β-1,3-葡聚糖酶是降解β-1,3-葡聚糖產(chǎn)生具備藥理活性的β-葡聚糖寡糖的有效酶工具。茯苓中多糖水解成寡糖具有抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)活性,利用β-1,3-葡聚糖酶可水解茯苓中β-1,3-糖苷鍵為主鏈的可溶性或不可溶性多糖,形成寡糖進而促進生物活性。因此,篩選產(chǎn)β-1,3-葡聚糖酶菌株、研究β-1,3-葡聚糖酶降解茯苓多糖的應用具有一定的意義與價值。論文基于高通量測序技術(shù)的應用,調(diào)查了土樣中微生物群落的分布及多樣性;從土樣中分離分泌葡聚糖酶的菌株并鑒定;利用分子手段獲得β-1,3-葡聚糖酶探究了其對茯苓多糖的降解;取得了以下主要結(jié)論:(1)高通量測序數(shù)據(jù)的分析結(jié)果顯示,茯苓培植土(FTL_1)中放線菌門(Actinobacteria)所占比例為18.64%,其豐度僅次于變形桿菌門(Proteobacteria),且放線菌門中鏈酶菌屬(Streptomyces)和節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)各占比為1.90%和0.78%。因此本研究確定從FTL_1篩選降解β型葡聚糖放線菌。(2)選用相應的篩選培養(yǎng)基,從FTL_1中分離了58株放線菌,其中11株具有β-1,3-葡聚糖酶活性。首次發(fā)現(xiàn)和報道了來自北里孢菌屬(Kitasatospora)菌株SYBCQL具有β-1,3-葡聚糖酶活性。來自鏈酶菌屬的菌株SYBC17產(chǎn)酶活力最高,為1.02 U·mg~(-1)。應用菌株SYBC17發(fā)酵了茯苓,最佳發(fā)酵時間為96 h,此時SYBC17對茯苓中多糖的降解效果最好。(3)克隆和分析了菌株SYBC17的兩個編碼β-1,3-葡聚糖酶的基因17-W和17-Q,菌株SYBCQL的基因QLK1,在分子水平驗證了分離的菌株產(chǎn)β-1,3-葡聚糖酶。重組酶QLK1,17-W和17-Q的酶活性分別為65.82 U·mg~(-1),132.90 U·mg~(-1)和14.70 U·mg~(-1)。重組酶17-W產(chǎn)率最高。(4)生物信息學分析顯示,三個酶蛋白全為糖苷水解酶家族16,分別由一個催化結(jié)構(gòu)域及一個碳水化合物結(jié)構(gòu)域組成,其中QLK1與17-W的碳水化合物結(jié)構(gòu)域為CMB13,而17-Q對應結(jié)構(gòu)域為CMB6。三個同源建模的酶蛋白與β-葡寡糖四糖成功實現(xiàn)分子對接,β-葡寡糖四糖均出現(xiàn)在催化活性中心的底物結(jié)合區(qū)。(5)酶學性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn),QLK1的最適溫度是60°C,17-W和17-Q的最適作用溫度均為55°C。QLK1和17-Q的最適pH是5.5,而17-W的最適pH是6.0,三個酶的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定良好;三個重組酶對底物的親和力由大到小的排序依次是17-W、QLK1、17-Q。(6)TLC分析重組酶對茯苓多糖的降解作用顯示,重組酶17-W降解后主要產(chǎn)生兩種類型的寡糖,17-Q降解后主要產(chǎn)生三種類型的寡糖。
【學位單位】：江南大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q78;TQ920.1
【部分圖文】：

第一章 緒論architecture) 如圖 1-2，其中兩個 β-折疊組成的片層分別各自由 6~7 條反向且平行的 β-鏈構(gòu)成兩個反向平行的 β-片層結(jié)構(gòu)十分保守，構(gòu)成 β-片層結(jié)構(gòu)的 β-折疊鏈的長度和彎曲度均基本致。β-折疊形成的片層彎曲形成的空隙使酶蛋白分子在表面形成了凹面和凸面，酶蛋白分的凹面一側(cè)是具有兩個殘基為催化活性中心 (E123 和 E128) 的底物結(jié)合區(qū)，催化域結(jié)構(gòu)高保守。一部分酶蛋白的凸側(cè)中有一個 Ca2+結(jié)合位點，均是由相距較近的 Glu14 和 Gly58 兩個距離較遠的 Asp237 的羰基氧(骨架羰基氧和羰基側(cè)鏈氧)與鈣離子相互作用，起到了穩(wěn)蛋白結(jié)構(gòu)的功能如圖 1-2(A)。還有一部分酶蛋白的凸側(cè)存在一個 Mg2+結(jié)合位點代替 Ca2+結(jié)位點，這個結(jié)合位點是由兩個相距較近的 ASP16 和 Gly66 氨基酸殘基 分別與 Asp269 的架羰基以及羧基氧，還有 Asp237 的羰基側(cè)鏈氧、水分子，共同與鎂離子相互作用。據(jù)以所述，金屬陽離子存在于酶催化凸面，而底物卻與酶沿著空間距離比較遠的凹面相互結(jié)合說明金屬離子 Ca2+及 Mg2+對酶的催化作用無直接影響[33, 34]。此外在圖 1-2(B)的 β-1,3-葡聚酶在Cys161-Cys169和Cys181-Cys186的位置存在兩個二硫鍵也對蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定作用有關(guān)但此結(jié)構(gòu)在 BglF 的結(jié)構(gòu)并沒有發(fā)現(xiàn) (圖 1-2(A))。

圖 1-1 茯苓菌核中多糖的提取Fig. 1-1 Extraction of polysaccharides from the P. cocos sclerotium多糖及其復合物(脂多糖、蛋白多糖)的防御病毒、降低血壓和血脂、多方面的藥理作用[55-58]。此外，多糖無毒副作用，安全系數(shù)高。因此中主要的多糖來源其在臨床上得以成功應用。但是從茯苓中提取的多在生物體內(nèi)不易被消化和吸收利用，造成大規(guī)模的臨床應用未能實現(xiàn)通過對茯苓中的多糖進行改性來增加其溶解性、提高它的生物活性。物法、物理法、化學法三種方法為主。其中對多糖結(jié)構(gòu)進行化學修飾其工藝流程繁瑣，無法大批量生產(chǎn)。Hamuro 等[59]根據(jù)液相、固相兩相成了水溶性的羧甲基茯苓多糖 (CMP)。生物降解則是利用外源酶與多降解的作用，該方法高效、專一性強、且無副反應。通過酶對天然多常因分子量過大、溶解性低和黏度高等影響造成其在臨床上的應用范揮。因此酶降解是一種多糖改性的主要手段，具有十分大的潛在應用不溶性 β-1,3-葡聚糖發(fā)揮藥理活性，利用 β-1,3-葡聚糖酶水解作用可使和抗腫瘤性質(zhì)的寡糖，有效提高多糖的生物活性及藥用價值[60, 61]。

酶作用于茯苓中多糖的降解情況，并將降解葡聚糖重組酶與小分子寡糖的進行對接后續(xù)重組酶產(chǎn)酶優(yōu)化及茯苓中多糖的生物活性及研究鋪墊。論文研究內(nèi)容文從以下方面開展研究：1) 利用高通量測序分析茯苓培植土及非培植土的土樣群落組成，確定在茯苓培植土 β-1,3-葡聚糖酶能力的優(yōu)勢菌群為放線菌。2) 從茯苓培植土中優(yōu)先篩選放線菌，再從分離的放線菌中篩選產(chǎn) β-1,3-葡聚糖酶菌株3) 將在放線菌中編碼 β-1,3-葡聚糖酶基因擴增后在宿主中表達，并利用鎳柱進行酶純純度的 β-1,3-葡聚糖酶重組酶。4) 對 β-1,3-葡聚糖酶進行同源建模并與 β-葡寡糖四糖進行分子對接。5) 研究重組酶的酶學性質(zhì)。6) 利用分離的產(chǎn) β-1,3-葡聚糖酶菌株發(fā)酵茯苓及重組酶作用于茯苓多糖降解產(chǎn)物分析對茯苓中多糖的降解。
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本文編號：2866146