發(fā)布時間：2020-11-01 20:51

　　 L-精氨酸已被證明是一氧化氮(NO)的前體,而NO有放松和擴(kuò)張血管等功能,因此L-精氨酸可用于許多臨床領(lǐng)域,近年來受到越來越多的關(guān)注。谷氨酸棒狀桿菌ATCC 14067是一種無芽孢的革蘭氏陽性菌,是多種氨基酸包括精氨酸的重要生產(chǎn)工業(yè)菌種,且符合食品安全要求。ArgR是谷氨酸棒狀桿菌中精氨酸生物合成途徑中的一個重要調(diào)控蛋白,但其具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚不十分清楚。目前谷氨酸棒狀桿菌ATCC 14067的全基因組測序已經(jīng)完成,基于這些數(shù)據(jù),可以用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(RNA-seq)測序獲得的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果進(jìn)行定量和功能關(guān)聯(lián)分析,以期篩選出一些可能為ArgR潛在的靶標(biāo)基因,為ArgR的調(diào)控機(jī)制深入研究提供線索。并利用凝膠阻滯實驗(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)對獲得的結(jié)果進(jìn)行驗證。具體研究內(nèi)容及結(jié)果如下:(1)C.glutamicum ATCC 14067來源的 ArgR 的克隆與表達(dá)構(gòu)建重組菌株E.coli BL21(DE3)/pET22b-argR,誘導(dǎo)表達(dá)ATCC 14067來源的ArgR,成功得到目的蛋白。利用Native PAGE及分子篩色譜柱對ArgR蛋白進(jìn)行分析,結(jié)果表明ArgR蛋白相對分子質(zhì)量在108 kDa左右,在天然狀態(tài)下ArgR蛋白為六聚體結(jié)構(gòu)。(2)利用RNA-seq技術(shù)對ArgR的生物學(xué)功能進(jìn)行一個初步的分析將野生型菌株Cglutamicum ATCC 14067中的基因表達(dá)與argR過表達(dá)菌株C.glutamicum ATCC 14067/pEC-XK99E-argR以及 ArgR 功能缺失突變菌株C.glutamicum ATCC 14067 ΔargR中的基因表達(dá)進(jìn)行比較。其中最大的基因表達(dá)差異出現(xiàn)在C.glutamicum/XK99E與Cglutamicum ΔargR之間,共有487個差異表達(dá)基因,其中位于精氨酸操縱子argCJBDFRGH中7個酶的基因的表達(dá)差異最大,精氨酸合成的旁路途徑中氨甲酰磷酸合成酶編碼基因carA,carB的表達(dá)量也存在較大差異。這些結(jié)果可能表明ArgR的功能缺失解除了對這些基因的阻遏,說明精氨酸生物合成基因的表達(dá)有可能受到ArgR的調(diào)控。(3)利用凝膠阻滯實驗驗證ArgR對精氨酸合成相關(guān)基因的調(diào)控作用合成生物素標(biāo)記的谷氨酸棒狀桿菌ATCC 14067來源的argC,argJ,argB,argF,argG,argH,carA基因片段,采用凝膠阻滯實驗(EMSA)觀察ArgR蛋白與其在體外的相互作用。結(jié)果表明,ArgR蛋白能夠在體外與argC、argB、argG、carA基因片段結(jié)合,且與argB基因的結(jié)合程度最大,說明ArgR蛋白可能通過與這些靶標(biāo)位點(diǎn)的結(jié)合來調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。
【學(xué)位單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：TQ922
【部分圖文】：

乙酰轉(zhuǎn)移酶的催化下從乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)移到答氨酸，于是乙醜谷氨酸可以再次循環(huán)進(jìn)入??Ｌ－精氨酸的合成過程，在該途徑中合成途徑第二個酶（乙酰谷氨酸激酶）受到Ｌ－精氨??酸的反饋抑制（．圖１－２）。在谷氨酸棒狀桿菌中精氨酸的合成存在一條旁路途徑，氨甲??酰磷酸可以通過形成瓜氨酸而進(jìn)入精氦酸合成途徑６該反應(yīng)由氨甲酰磷酸合成酶??（ｃａｒｂａｍｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ?ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＣＰＳ）催化?Ｃ〇２、谷氣酸和?ＡＴＰ?而形成〇．??１．２．２谷氨酸棒狀桿菌中與Ｌ－精氨酸生物合成相關(guān)的基因??Ｌ－精氮酸生物合成暴些細(xì)菌（假單胞菌ｆｔｅＭｔ／ｏｗｃｗａｓ?ｓｐｐ．和藍(lán)藻菌??ａｃｔｅｄ臟ｓｐｐ．）中’３］是分散在染色體ＤＮＡ上的，而在另外一些細(xì)菌（結(jié)核分枝桿菌??Ｍ祕ｅｆ？／／〇５７＋５和谷氣酸棒狀桿菌Ｇ?ｇ／ｗ／猶／ｃ麵）中是成儀集中的［２４’２５］。在谷氨酸棒??狀桿菌中，精氨酸生物合成基固簇ａｒｇＣ／ＳＤＥＲＧ漢由８個結(jié)構(gòu)基因組成，該基囡簇：中存??在ａｒｇＣ和ａ，＃？兩個趨動子，可以獨(dú)立轉(zhuǎn)最產(chǎn)：生兩個有序排列的操縱子??和〇嘆（＾２６］，可編碼從谷氨酸到精氨酸代謝合成所必需的所有酶系（圖１－３）。在Ｌ－??精氨酸生物合成的經(jīng)濟(jì)循環(huán)途徑中，乙酰谷氨酸激酶（由編碼）是精氨酸生物合??成的關(guān)鍵酶，它受到高濃度的Ｌ－精氨酸的反饋抑制。??ａｒｇＣ?ａｒｇＪ?ａｒｇＢ?ａｒｇＤ?ａｒｇＦ?ａｒｇＲ?ａｒｇＧ?ａｒｇＨ??５’?Ｈｌ０７４ｂｐ％—｜?１１６７６？＼－｜９５＾＾?１１７６ｂ＾９６０ｂｐ＾５１６ｂｐ＞—?１４３４ｂｐ＾Ｖ－?３

乙酰轉(zhuǎn)移酶的催化下從乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)移到答氨酸，于是乙醜谷氨酸可以再次循環(huán)進(jìn)入??Ｌ－精氨酸的合成過程，在該途徑中合成途徑第二個酶（乙酰谷氨酸激酶）受到Ｌ－精氨??酸的反饋抑制（．圖１－２）。在谷氨酸棒狀桿菌中精氨酸的合成存在一條旁路途徑，氨甲??酰磷酸可以通過形成瓜氨酸而進(jìn)入精氦酸合成途徑６該反應(yīng)由氨甲酰磷酸合成酶??（ｃａｒｂａｍｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ?ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＣＰＳ）催化?Ｃ〇２、谷氣酸和?ＡＴＰ?而形成〇．??１．２．２谷氨酸棒狀桿菌中與Ｌ－精氨酸生物合成相關(guān)的基因??Ｌ－精氮酸生物合成暴些細(xì)菌（假單胞菌ｆｔｅＭｔ／ｏｗｃｗａｓ?ｓｐｐ．和藍(lán)藻菌??ａｃｔｅｄ臟ｓｐｐ．）中’３］是分散在染色體ＤＮＡ上的，而在另外一些細(xì)菌（結(jié)核分枝桿菌??Ｍ祕ｅｆ？／／〇５７＋５和谷氣酸棒狀桿菌Ｇ?ｇ／ｗ／猶／ｃ麵）中是成儀集中的［２４’２５］。在谷氨酸棒??狀桿菌中，精氨酸生物合成基固簇ａｒｇＣ／ＳＤＥＲＧ漢由８個結(jié)構(gòu)基因組成，該基囡簇：中存??在ａｒｇＣ和ａ，＃？兩個趨動子，可以獨(dú)立轉(zhuǎn)最產(chǎn)：生兩個有序排列的操縱子??和〇嘆（＾２６］，可編碼從谷氨酸到精氨酸代謝合成所必需的所有酶系（圖１－３）。在Ｌ－??精氨酸生物合成的經(jīng)濟(jì)循環(huán)途徑中，乙酰谷氨酸激酶（由編碼）是精氨酸生物合??成的關(guān)鍵酶，它受到高濃度的Ｌ－精氨酸的反饋抑制。??ａｒｇＣ?ａｒｇＪ?ａｒｇＢ?ａｒｇＤ?ａｒｇＦ?ａｒｇＲ?ａｒｇＧ?ａｒｇＨ??５’?Ｈｌ０７４ｂｐ％—｜?１１６７６？＼－｜９５＾＾?１１７６ｂ＾９６０ｂｐ＾５１６ｂｐ＞—?１４３４ｂｐ＾Ｖ－?３

?ａｒｇＲ＾＾?ａｒｇＥ?ａｒｇＢ??圖１－４大腸桿菌中精氨酸生物合成基因簇??Ｆｉｇ．１－４?Ｔｈｅ?ａｒｇｉｎｉｎｅ?ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ?ｇｅｎｅ?ｃｌｕｓｔｅｒ?ｉｎ?Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ?ｃｏｌｉ?Ｋ１２．??在大腸桿菌中ＡｒｇＲ與四個基鼠《７知，ａｒｇＤ，ａｒｇＦ，ａｒｇ＜？和兩個操縱子ｃａｒＡ８和??ａｒｇＥＣ冊基菌簇的啟動子區(qū)ＤＮＡ的體外結(jié)合實驗表明，ＡｒｇＲ六聚體在Ｌ－精氨酸存在??下同時與禽動子中的兩個相鄰的ＡＲＧ?ｂｏｘｅｓ結(jié)合。ＡｒｇＲ對稱地結(jié)合在兩個相鄰ＡＲＧ??ｂｏｘｅｓ的四個螺旋圈，凰只結(jié)合在ＤＮＡ雙螺旋的一個面上ＡｒｇＲ與每個ＡＲＧ?ｂｏｘ的主??凹槽形成接觸，但不接觸中心的三個堿基對。ＡｒｇＲ與在四個連續(xù)的主溝中對稱分布的??高度保守的四個堿基Ｇ接觸，與小溝中堿基Ａ相接觸。ＡｒｇＲ也可以與單個ＡＲＧ?ｂｏｘ??結(jié)合ｒ但其蠢翁力比與兩個ＡＲＧ?ｂｏｘｅｓ低約１００倍。相鄰的ＡＲＧ?ｂｏｘｅｓ對于與ＡｒｇＲ的??結(jié)合表現(xiàn)出合作性
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 尹海權(quán);王明召;;分離DNA的瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)[J];化學(xué)教育;2012年12期

2 王昕;;高效液相色譜研究進(jìn)展[J];光明中醫(yī);2011年01期

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1 袁永;鈍齒棒桿菌ArgR的凝膠阻滯實驗及單增李斯特菌actA、inlB、p60表達(dá)載體的構(gòu)建[D];南昌大學(xué);2012年

本文編號：2866081