發(fā)布時間：2020-10-20 15:06

　　 β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)能通過催化β-1,4-甘露糖苷鍵,將甘露聚糖水解為甘露糖和甘露低聚糖。作為一種重要的工業(yè)用酶制劑,β-甘露聚糖酶被廣泛應用于動物飼料、食品加工、生物漂白、紡織、可再生能源等領域。由于一些應用領域在加工過程中需要進行高溫處理,如飼料制粒、可再生能源生產(chǎn)等,這就要求所開發(fā)的β-甘露聚糖酶具有良好的耐高溫性能。目前,市面上存在的β-甘露聚糖酶在耐高溫性能方面往往達不到要求,因此,開發(fā)一種具有優(yōu)良耐高溫能力的β-甘露聚糖酶就顯得非常迫切,具有良好的應用前景。在本研究中,我們從熱泉中(水溫高于68℃)分離、篩選出一株產(chǎn)β-甘露聚糖酶的嗜熱枯草芽孢桿菌(TBS2)。以TBS2為出發(fā)菌株,經(jīng)過基因克隆,在畢赤酵母X33中進行表達,獲得了一種重組耐高溫β-甘露聚糖酶(ReTMan26)。采用純化后的ReTMan26,完成了該酶的相關酶學性質(zhì)檢測并對其耐高溫機理進行了相應分析。在此基礎上,通過密碼子優(yōu)化,大幅提高了ReTMan26在畢赤酵母中的表達水平。此外,還確定了來源于生物柴油生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物粗甘油可以作為一種廉價碳源,用于畢赤酵母進行ReTMan26的發(fā)酵生產(chǎn)。主要研究結果如下:(1)從熱泉中分離、篩選出一株產(chǎn)β-甘露聚糖酶的細菌,通過形態(tài)觀察、生理生化培養(yǎng)特征、16S rDNA序列比對及構建系統(tǒng)發(fā)育樹,鑒定出該細菌為一種嗜熱枯草芽孢桿菌(TBS2)。該菌可在pH 4.0-9.0、35-80℃條件下生長,最適生長pH為6.0-7.0、最適生長溫度為50℃。TBS2所產(chǎn)的β-甘露聚糖酶(BS-Man)的最適反應pH為6.0,最適反應溫度為55℃,在90℃、水溶液狀態(tài)下處理10 min,剩余酶活達到63.6%。(2)通過從NCBI中查找出其它來源于枯草芽孢桿菌的β-甘露聚糖酶保守序列,設計引物,成功克隆出來源于嗜熱枯草芽孢桿菌TBS2中的耐高溫β-甘露聚糖酶基因TBS2-Man。TBS2-Man基因序列長957 bp,編碼318個氨基酸。通過蛋白結構及基因序列分析,該β-甘露聚糖酶屬于第26糖苷水解酶家族,含有3個潛在的N-糖基化位點(N8、N26與N255)及2個半胱氨酸位點(C48、C68)。在此基礎上,采用克隆出的基因TBS2-Man,構建并篩選出了一株產(chǎn)重組耐高溫β-甘露聚糖酶(ReTMan26)的畢赤酵母工程菌Orig-pPICZαA-X33,該菌株在搖瓶中的發(fā)酵水平為312 U×mL~(-1),在50 L罐中通過高密度液體發(fā)酵的表達水平為5435 U×m L~(-1)。(3)對重組畢赤酵母Orig-pPICZαA-X33表達的ReTMan26純化后進行酶學性質(zhì)檢測,結果表明:該酶的最適pH為6.0,在pH 2.0-8.0范圍內(nèi)穩(wěn)定;最適反應溫度為60℃,有效作用溫度范圍為20-100℃,且在100℃、水溶液條件下處理10 min后,剩余酶活仍然可以達到58.6%;10 mmol×L~(-1)的Mg~(2+)、Mn~(2+)對ReTMan26活性具有促進作用,而Ag~+、Hg~(2+)及SDS對ReTMan26具有較強的抑制作用;ReTMan26的V_(max)為1612 U×mg~(-1)蛋白,K_m值為4.35 mg×mL~(-1)。此外,ReTMan26表現(xiàn)出較強的抗蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶)的消化能力。以上酶學性質(zhì)表明,除其它潛在工業(yè)應用外,ReTMan26適宜作為一種飼料酶進行應用。(4)為探究ReTMan26的耐高溫機理,對該酶進行了氨基酸序列比對及蛋白質(zhì)三維結構分析。結果表明:更短的氨基酸序列、部分氨基酸位點不同、二硫鍵及N-糖基化可能是造成ReTMan26具有優(yōu)良耐高溫性能的根本原因。為進一步確定N-糖基化及二硫鍵對ReTMan26的穩(wěn)定性,尤其是耐高溫性能的影響,分別采用天然蛋白去糖基化試劑盒及定點突變的方法,去除了ReTMan26中的N-多糖鏈及2個半胱氨酸位點(C48、C68)。研究發(fā)現(xiàn),N-糖基化可提高ReTMan26的最適反應溫度、耐熱性能分別為5℃和7℃。此外,N-糖基化還可提高ReTMan26抗胃蛋白酶及胰蛋白酶的消化性能分別為23.7%及25.6%。二硫鍵對ReTMan26的最適反應溫度及提高抗消化酶性能沒有影響,但可提高耐熱性能約3℃。(5)為進一步提高ReTMan26在畢赤酵母X33中的表達水平,對來自于TBS2中的原始ReTMan26編碼基因TBS2-Man(Orig)進行了密碼子優(yōu)化,并構建出了一株含優(yōu)化基因(CoOp)的新重組畢赤酵母CoOp-p PICZαA-X33生產(chǎn)菌株。該菌株在高密度液體發(fā)酵中,ReTMan26的表達水平為10750 U×m L~(-1),在相同條件下,其生產(chǎn)性能比原重組畢赤酵母Orig-pPICZαA-X33(5412 U×mL~(-1))提高了98.6%。另外,在經(jīng)過密碼子優(yōu)化的基因(CoOp)基礎上,繼續(xù)對該基因上游的信號肽(α-factor)進行了Kozak序列(GCCACCATG)改造,實驗結果表明,該方法對提高ReTMan26在畢赤酵母中的表達水平?jīng)]有效果,但這對今后構建畢赤酵母重組工程菌表達系統(tǒng),具有一定的參考作用。(6)為降低ReTMan26的生產(chǎn)成本,充分利用廢棄資源,采用來源于生物柴油生產(chǎn)的副產(chǎn)物粗甘油作為畢赤酵母快速生長期間的唯一碳源,結果表明:粗甘油中的皂類物質(zhì)在添加濃度低于0.3%(相對于發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量體積比)時,不會抑制高密度液體發(fā)酵時的畢赤酵母菌體生長及ReTMan26生產(chǎn)。在此基礎上,不經(jīng)任何前處理的粗甘油,可替代純甘油用于ReTMan26的發(fā)酵生產(chǎn)。通過采用粗甘油替代純甘油,ReTMan26的全部發(fā)酵生產(chǎn)成本可降低約4.2%。
【學位單位】：江南大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：TQ926
【部分圖文】：

[19]。β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖的示意圖如圖1-2所示：圖1-2 β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖示意圖Fig. 1-2 The schematic diagram of mannan hydrolysis by β-mannanase1.2 國內(nèi)外研究、應用進展1.2.1 β-甘露聚糖酶的國內(nèi)外研究、應用進展人們對β-甘露聚糖酶的研究、應用開發(fā)可以追溯到二十世紀五十年代。Courtios等人于1958年首次從紫花苜蓿(Alfalfa)中發(fā)現(xiàn)一種β-甘露聚糖酶[20]， Williams 和Doetsch于1960年報道從瘤胃厭氧鏈球菌(anaerobic rumen Streptococci)中獲得一種β-甘露聚糖酶[21]， 隨后，Reese和Shibata等人于1965年第一次系統(tǒng)性地提出了β-甘露聚糖酶的概念[22]。國內(nèi)外目前對β-甘露聚糖酶的研究主要包括β-甘露聚糖酶的來源與理化性質(zhì)、β-甘露聚糖酶的蛋白結構分析、β-甘露聚糖酶的發(fā)酵與分離純化、β-甘露聚糖酶的基因克隆與表達，以及β-甘露聚糖酶的應用開發(fā)等方面。1.2.1.1 β-甘露聚糖酶的來源及理化性質(zhì)β-甘露聚糖酶廣泛存在于植物、動物及微生物中，例如，在一些低等動物的腸道分泌液[23-25]以及一些植物的發(fā)芽種子中[26, 27]，都發(fā)現(xiàn)有β-甘露聚糖酶的存在。

露聚糖酶在蛋白質(zhì)三維結構方面會存在一定的差異，尤其是GH5、GH26及GH113這3個家族與GH134家族相差較大。圖1-3為分別屬于四種不同糖苷水解酶家族的β-甘露聚糖酶蛋白三維結構模型圖。圖1-3 屬于不同類型糖苷水解家族的典型β-甘露聚糖酶蛋白三維結構圖A：屬于GH5家族、來源于子囊菌(Chrysonilia Sitophila)的β-甘露聚糖酶CsMan5 (PDB ID號：4AWE)；B：屬于GH26家族、來源于纖維弧菌(Cellvibrio japonicas)的β-甘露聚糖酶CjMan26C (PDBID號：4CD4)；C：屬于GH113家族、來源于酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)的β-甘露聚糖酶AaManA (PDB ID號：4CD6)；D：屬于GH134家族、來源于鏈霉菌屬NRRL B-24484(Streptomyces sp. NRRL B-24484)的β-甘露聚糖酶SsGH134 (PDB ID號：5JU9)。Fig. 1-3 Three-dimensional structures of typical β-mananases belonging todifferent glycoside hydrolase familiesA: GH5 -mannanase CsMan5 from Chrysonilia Sitophila (PDB ID: 4AWE); B: GH26 -mannanaseCjMan26C from Cellvibrio japonicas (PDB ID: 4CD4); C: GH113 -mannanase AaManA fromAlicyclobacillus acidocaldarius (PDB ID: 4CD6); D: GH134 -Mannanase SsGH134 from Streptomycessp. NRRL B-24484 (PDB ID: 5JU9).雖然各種β-甘露聚糖酶在氨基酸序列上會存在一定差異，但除GH134家族外，GH5、GH26及GH113的β-甘露聚糖酶的催化域都是由8個α-螺旋及8個β-折疊交替排列形成的TIM桶狀結構，其中排列在一起的8個β-折疊片段形成桶狀內(nèi)部凹槽結構，與之相連接的α-螺旋則組成桶的外沿。另外，在β-甘露聚糖酶的TIM桶狀結構形成過程中，由處于一級氨基酸序列上不同位置的8個保守氨基酸構成該桶狀的活性口袋

有助于所表達的蛋白進行檢測和純化。另外，pPICZαA質(zhì)粒上含有一個強啟動子pAOX1，嚴格受甲醇的誘導和調(diào)控。pPICZαA的結構見圖1-4。圖1-4 表達載體pPICZαA結構示意圖Fig. 1-4 The physical map of pPICZαA vector1.2.2.1.2 啟動子目前最常用的啟動子為pAOX1，它可以對醇氧化酶基因AOX1進行嚴格調(diào)控，在甲醇存在時，可誘導該啟動子下游的外源基因進行表達。至今為止，已有許多外源蛋白通過該啟動子獲得了表達，如來源于人類大腦組織的乙酰膽堿脂酶[144]、來源于釀酒酵母的超氧化物歧化酶(SOD)[145]以及來源于嗜熱毛殼菌(Chaetomium thermophilum)的耐熱木聚糖酶等[146]。另外，作為不利用甲醇進行誘導的3-磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動子pGAP(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter)被Waterham 等于1997 年開發(fā)出來[147]。pGAP啟動子可使畢赤酵母利用葡萄糖進行誘導表達，在組成型質(zhì)粒pGAPZa (A,B, C)中即存在該啟動子。據(jù)報道，已有部分外源蛋白通過pGAP啟動子獲得了表達
【參考文獻】

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1 趙月菊;薛燕芬;馬延和;;β-甘露聚糖酶的結構生物學研究現(xiàn)狀和展望[J];微生物學報;2009年09期

2 段蕾;高潤池;許波;孟艷芬;黃遵錫;;β-甘露聚糖酶產(chǎn)生菌的分離·鑒定及酶學特性研究[J];安徽農(nóng)業(yè)科學;2008年24期

3 張輝;;1株青霉固體發(fā)酵產(chǎn)酸性β-甘露聚糖酶條件優(yōu)化[J];安徽農(nóng)業(yè)科學;2008年05期

4 劉朝輝;武偉娜;劉躍;齊崴;何志敏;;保護劑提高β-甘露聚糖酶熱穩(wěn)定性的研究[J];天津大學學報;2008年01期

5 韋赟;江正強;李里特;柴萍萍;日下部功;;枯草芽孢桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶固體發(fā)酵條件的優(yōu)化[J];微生物學通報;2006年01期

6 王和平,范文斌,張七斤,王龍,郭綏芝;里氏木霉RutC-30β-甘露聚糖酶的制備與純化方法的研究[J];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版);2003年03期

7 陳秀敏,傅德賢,歐陽藩;魔芋葡甘露聚糖化學結構及改性研究進展[J];天然產(chǎn)物研究與開發(fā);2002年02期

8 唐雪明,王正祥,諸葛健;具有工業(yè)應用價值的高熱穩(wěn)定性極端酶[J];食品與發(fā)酵工業(yè);2001年05期

9 楊艷燕,李小明,李順意,高尚,倪紅;魔芋低聚糖對小鼠血糖含量和抗氧化能力的影響[J];中草藥;2001年02期

10 吳襟,何秉旺;諾卡氏菌形放線菌β甘露聚糖酶的純化和性質(zhì)[J];微生物學報;2000年01期

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1 李慧玲;高產(chǎn)β-甘露聚糖酶菌株選育、構建及其酶學特性研究[D];東北林業(yè)大學;2014年

本文編號：2848833