葡萄糖耐量因子(GTF)作為酵母富集Cr(Ⅲ)生成的產(chǎn)物,可以增強(qiáng)胰島素的功能,促進(jìn)糖、脂代謝,逆轉(zhuǎn)葡萄糖耐受不良,提高糖耐量;保護(hù)胰島素β細(xì)胞,并且增加胰島素受體數(shù)量,提高親和力等功能。由于酵母鉻具有產(chǎn)量大,安全性高等優(yōu)點(diǎn)而備受國(guó)內(nèi)外科學(xué)家關(guān)注。但是,酵母富集Cr(Ⅲ)的機(jī)理卻一直未被闡明。因此,本文以本實(shí)驗(yàn)室保藏的高產(chǎn)GTF酵母菌株YSI-3.7為研究對(duì)象,從酵母中鉻的分布、酵母表面基團(tuán)對(duì)酵母富鉻的影響、酵母富鉻過程中基因的表達(dá)以及酵母細(xì)胞生理過程中氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化等方面進(jìn)行了探究。在一定程度上闡明酵母富集Cr(Ⅲ)形成GTF機(jī)理,為GTF的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。主要結(jié)論如下:1.Cr3+濃度為500μg/m L時(shí),YSI-3.7酵母細(xì)胞吸附的總鉻(1803.87μg/g·dcw)和有機(jī)鉻(1133.91μg/g·dcw)含量最高。通過EDTA螯合洗脫和酶解洗脫對(duì)酵母細(xì)胞組分進(jìn)行分離,印證分析了鉻在不同細(xì)胞部位的分布。細(xì)胞壁上富集的鉻基本為無機(jī)鉻,占菌體富集總鉻的14.43%;原生質(zhì)體中的鉻占酵母富集總鉻的85.57%,其中73.29%主要為有機(jī)鉻。利用EDS能譜掃描及TOF-SIMS對(duì)酵母菌體進(jìn)行橫截面和深度剖析鉻含量的分析表明鉻在酵母細(xì)胞中呈均勻分布。2.對(duì)酵母細(xì)胞表面不同基團(tuán)(氨基、羧基、磷酸基、酯基)分別進(jìn)行化學(xué)屏蔽,結(jié)果表明酵母表面氨基、羧基和磷酸基團(tuán)對(duì)酵母富鉻量有較大影響。紅外光譜分析結(jié)果也印證了上述結(jié)果。3.利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析技術(shù)對(duì)空白酵母和富鉻酵母菌體進(jìn)行分析,分析RNA-Seq測(cè)序結(jié)果表明,空白組酵母和500μg/m L Cr3+培養(yǎng)的富鉻酵母中共鑒定出共鑒定5987個(gè)基因,其中5796個(gè)基因在兩組酵母中均被檢測(cè)出來,2333個(gè)具有顯著差異表達(dá)的基因。其中,有1273個(gè)基因表達(dá)上調(diào),1060個(gè)基因下調(diào)。根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋歸類,98條代謝途徑發(fā)生了改變,其中對(duì)核糖體代謝、硫代謝、氧化壓力代謝相關(guān)、碳代謝,半胱氨酸和蛋氨酸代謝等途徑影響最大。根據(jù)GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋歸類,分別為生物途徑(778條途徑)、細(xì)胞組分(173條途徑)、分子功能(594條途徑)三類;其中表達(dá)差異比較顯著的基因主要有GSH2,SPE4,MET16,CYC1,MSN4等。4.鉻濃度升高導(dǎo)致酵母細(xì)胞膜脂過氧化程度加重。在較低濃度(0~500μg/m L)的Cr3+作用下,酵母通過增加總抗氧化能力(T-AOC),還原型谷胱甘肽(GSH)、巰基含量和谷胱甘肽氧化酶(GSH-Px)活力等防御Cr3+的氧化脅迫。而細(xì)胞中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(CAT)活力在此過程中變化不明顯。1 mmol/L Na2SO3可增加酵母細(xì)胞巰基、GSH、T-AOC含量,從而緩解鉻對(duì)于酵母的脅迫作用,提高酵母的生物量和酵母細(xì)胞中有機(jī)鉻和總鉻的含量。
【學(xué)位單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：TQ920.1
【部分圖文】：

科學(xué)院碩士畢業(yè)論文 第二章 GTF 高產(chǎn)酵母菌體中鉻（續(xù)養(yǎng)液中 Cr3+濃度μg/mL細(xì)胞干重g/100 mL有機(jī)鉻μg/g dcw總鉻μg/g·dcw有機(jī)鉻/總（%）500 0.97 ±0.05 725.55 ±55.08 1255.53 ±43.75 57.74 ±2800 0.45 ±0.02 536.25 ±36.89 1812.22 ±38.24 29.62 ±2

圖 2.4 不同濃度 Cr3+培養(yǎng)的酵母 YSI-3.7 菌體掃描電鏡圖Fig. 2.4 Scanning electron microscopy(SEM) of YSI-3.7 cultivated atvarious concentrations of Cr3+圖 A 為 0 μg /mL Cr3+培養(yǎng)的 YSI-3.7（對(duì)照）；圖 B 為 200 μg/mL Cr3+培養(yǎng)的 YSI-3.7；圖 C 為 500 μg/mL Cr3+培養(yǎng)的 YSI-3.7；圖 D 為 800 μg/mL Cr3+培養(yǎng)的 YSI-3.7。圖 2.4 所示，未加 Cr3+培養(yǎng)的 YSI-3.7（圖 A）形狀是規(guī)則的橢圓形，立體形狀飽滿式為芽殖。在 200 μg/mL Cr3+脅迫下，酵母細(xì)胞表面沒有顯著變化，胞體上有多個(gè)此濃度下，酵母的出芽繁殖活動(dòng)并沒有受到顯著影響。由酵母表面出現(xiàn)芽痕的數(shù)量斷菌齡，而由上圖看出，200 μg/mLCr3+脅迫下具有相同菌齡的 YSI-3.7 相對(duì)于空白狀變長(zhǎng)。Cr3+濃度增加（500 μg/mL）酵母細(xì)胞形狀變得更長(zhǎng)，且表面出現(xiàn)了沉淀，酵母細(xì)胞壁上富集。同樣，800 μg/mLCr3+濃度時(shí)，酵母細(xì)胞形變加劇，表面富集更而，圖中各個(gè) Cr3+濃度條件下，YSI-3.7 細(xì)胞壁均未受到明顯破壞，都有一個(gè)至多說明在上述 Cr3+濃度下，YSI-3.7 可以正常繁殖。生物對(duì)有害物質(zhì)和環(huán)境改變有一定的適應(yīng)性和抵抗力。環(huán)境中的重金屬在低濃度時(shí)，因?yàn)檫@些金屬是微生物細(xì)胞中的某些酶的必需成分；但當(dāng)重金屬含量超過其臨界濃物具有毒性，甚至?xí)䴕⑺牢⑸铮▌Ⅹ槪?009；葉錦韶，2002）。從富鉻酵母掃描

圖 2.5 不同濃度 Cr3+培養(yǎng)的酵母菌體透射電鏡圖Fig. 2.5 Transmission electron microscopy(TEM) of YSI-3.7 cultivated atvarious concentrations of Cr3+圖 A 為 0 μg /mL Cr3+培養(yǎng)的 YSI-3.7（對(duì)照）；圖 B 為 200 μg/mL Cr3+培養(yǎng)的 YSI-3.7；圖 C 為 500 μg/mL Cr3+培養(yǎng)的 YSI-3.7；圖 D 為 800 μg/mL Cr3+培養(yǎng)的 YSI-3.7。金屬的生理作用或毒害作用必須以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)為前提。大部分細(xì)胞可采用快速吸收類重金屬離子吸收系統(tǒng)（Nies et al., 1999）�？焖傥胀ǔH靠化學(xué)滲透離子梯度或消耗降低低能量，緩慢吸收則需要借助 ATP 水解作為能量或化學(xué)滲透梯度，需要耗費(fèi)射電鏡對(duì)鉻脅迫下的酵母細(xì)胞進(jìn)行觀察。如圖 2.5 所示，未加 Cr3+處理的 YSI-3.7的橢圓形，并且鋨酸染色比較均勻，細(xì)胞核較小，線粒體沿著細(xì)胞輪廓均勻地排布；200 μg/mL Cr3+處理的 YSI-3.7 也是呈橢圓形，但是細(xì)胞稍微拉長(zhǎng)，細(xì)胞核變大周圍出現(xiàn)白色空泡。此時(shí)，進(jìn)入酵母的鉻對(duì)于酵母內(nèi)部沒有產(chǎn)生可見的破壞；當(dāng) C 500 μg/mL 和 800 μg/mL 時(shí)，細(xì)胞變成了更細(xì)長(zhǎng)的無規(guī)則的形狀，并且細(xì)胞核中出更大。隨著 Cr3+濃度的升高，YSI-3.7 細(xì)胞的形狀變長(zhǎng)，細(xì)胞壁逐漸變薄，并且內(nèi)數(shù)目越來越多，破壞主要集中在細(xì)胞核上，細(xì)胞核更容易被高濃度的鉻破壞。推測(cè)性（核孔 40～70 nm）比其它生物膜大有關(guān)。當(dāng)環(huán)境中存在低濃度 Cr3+，微生物可3+3+3+
【參考文獻(xiàn)】

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