發(fā)布時(shí)間：2020-10-18 16:47

　　 厭氧發(fā)酵制氫技術(shù)是近幾年科學(xué)家們關(guān)注較多的生物制氫技術(shù),利用此技術(shù)將處理高濃度有機(jī)廢水與產(chǎn)氫有效結(jié)合,逐步研發(fā)了產(chǎn)氫效率較高,運(yùn)行穩(wěn)定,并能適用于工業(yè)化生產(chǎn)的厭氧發(fā)酵制氫反應(yīng)器。開展厭氧發(fā)酵制氫反應(yīng)器與產(chǎn)氫細(xì)菌蛋白質(zhì)組學(xué)研究為進(jìn)一步提高厭氧發(fā)酵制氫反應(yīng)器的產(chǎn)氫效率提供重要信息和技術(shù)支持。本研究通過連續(xù)流攪拌槽式反應(yīng)器(CSTR)的連續(xù)運(yùn)行處理高濃度糖蜜廢水,通過對(duì)工程參數(shù)的控制維持反應(yīng)器的穩(wěn)定運(yùn)行,并對(duì)活性污泥進(jìn)行馴化。采用Illumina MiSeq平臺(tái)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)比分析了啟動(dòng)運(yùn)行不同階段的優(yōu)勢(shì)菌群組成,篩選到高效產(chǎn)氫菌株,進(jìn)而采用基于iTRAQ標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),分析了該菌株在產(chǎn)氫過程中的豐度差異蛋白質(zhì)。結(jié)果表明,不同起始污泥負(fù)荷的兩次CSTR的啟動(dòng)運(yùn)行均較好地完成了活性污泥的馴化。兩次CSTR反應(yīng)器運(yùn)行的出水p H值均穩(wěn)定在4.7~4.9,經(jīng)過馴化后的活性污泥具有良好的沉降性能。兩次反應(yīng)器運(yùn)行的液相發(fā)酵產(chǎn)物總量分別為1,298mg?L~(-1)和1,934 mg?L~(-1),其中乙酸和丁酸質(zhì)量濃度占發(fā)酵產(chǎn)物總質(zhì)量的73.1%和70.8%,因此兩次CSTR反應(yīng)器啟動(dòng)運(yùn)行均為丁酸型發(fā)酵�；钚晕勰鄡�(yōu)勢(shì)菌群分析表明,兩次CSTR反應(yīng)器的啟動(dòng)運(yùn)行通過對(duì)活性污泥的馴化分別形成了以產(chǎn)乙醇桿菌屬(Ethanoligenes)、巨球型菌屬(Megasphaera)和Ⅳ型梭菌(ClostridiumⅣ)為主的優(yōu)勢(shì)菌群組成和以巨球型菌屬(Megasphaera)、產(chǎn)乙醇桿菌屬(Ethanoligenens)為主的優(yōu)勢(shì)菌群組成。經(jīng)過兩次CSTR反應(yīng)器啟動(dòng)運(yùn)行對(duì)活性污泥的馴化,與產(chǎn)氫功能相關(guān)的菌種均占污泥中微生物總量的40%以上。這表明CSTR反應(yīng)器較好的完成了兩次啟動(dòng)運(yùn)行,并達(dá)到污泥馴化的目的,通過分離篩和獲得目標(biāo)菌種。對(duì)馴化后的活性污泥進(jìn)行分離篩選,初步篩選出產(chǎn)氫能力較高菌種共8株,進(jìn)一步進(jìn)行間歇產(chǎn)氫實(shí)驗(yàn),菌株WJY-29產(chǎn)氫能力最高,累計(jì)產(chǎn)氣量和累計(jì)產(chǎn)氫量,分別為3,464mL/L-culture和2,004 m L/L-culture,16SrDNA分析表明,菌株WJY-29與拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii NRRL B-598)基因序列同源性達(dá)99%。選取pH為6.5的培養(yǎng)基條件,培養(yǎng)時(shí)間分別為10h、15h和30h的拜氏梭菌進(jìn)行了基于iTRAQ標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析。經(jīng)過三次生物學(xué)重復(fù)鑒定到757種可信差異蛋白質(zhì),其中378種蛋白質(zhì)豐度上升,339種蛋白質(zhì)豐度下降。糖酵解過程中的6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、烯醇化酶(磷酸丙酮酸水合酶)、醛脫氫酶,以及果糖二磷酸醛縮酶在拜氏梭菌WJY-29不同培養(yǎng)時(shí)間下蛋白質(zhì)豐度明顯上升。這表明拜氏梭菌WJY-29通過糖酵解途徑分解葡萄糖。此外,鐵氧還蛋白[FeFe]-氫化酶、甲酸脫氫酶、丙酮酸黃素氧化還原酶在拜氏梭菌WJY-29不同培養(yǎng)時(shí)間下蛋白質(zhì)豐度上升顯著。由此可推斷拜氏梭菌WJY-29的產(chǎn)氫途徑為,在嚴(yán)格厭氧的培養(yǎng)基中,拜氏梭菌WJY-29酵解葡萄糖,將葡萄糖分解成丙酮酸,在丙酮酸脫氫酶的作用下丙酮酸脫羧,羥乙基與酶的焦磷酸硫胺素結(jié)合,然后生成乙酰輔酶A,乙酰輔酶A進(jìn)一步脫氫,還原鐵氧還蛋白,進(jìn)而在氫化酶的作用下,鐵氧還蛋白被鐵氧還蛋白氫化酶重新氧化并釋放出H_2。
【學(xué)位單位】：上海師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：TQ052.5;TQ116.2
【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 緒論
    1.1 引言
    1.2 厭氧發(fā)酵制氫
        1.2.1 乙醇型發(fā)酵
        1.2.2 丙酸型發(fā)酵
        1.2.3 混合酸型發(fā)酵
        1.2.4 丁酸型發(fā)酵
    1.3 厭氧發(fā)酵反應(yīng)器的啟動(dòng)運(yùn)行及活性污泥菌群結(jié)構(gòu)
    1.4 產(chǎn)氫菌的篩選及培養(yǎng)基的優(yōu)化
    1.5 產(chǎn)氫菌蛋白質(zhì)組學(xué)
        1.5.1 產(chǎn)氫菌代謝途徑中相關(guān)酶蛋白質(zhì)研究進(jìn)展
    1.6 課題背景
        1.6.1 課題目的及意義
        1.6.2 課題主要研究?jī)?nèi)容
第2章 實(shí)驗(yàn)材料與方法
    2.1 CSTR厭氧發(fā)酵制氫反應(yīng)器的實(shí)驗(yàn)裝置與材料
        2.1.1 CSTR反應(yīng)器啟動(dòng)運(yùn)行實(shí)驗(yàn)裝置
        2.1.2 接種污泥
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)底物
    2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
    2.3 反應(yīng)器運(yùn)行的工程參數(shù)測(cè)定
        2.3.1 COD的測(cè)定
        2.3.2 pH的測(cè)定
        2.3.3 液相發(fā)酵產(chǎn)物的測(cè)定
        2.3.4 活性污泥沉降體積的測(cè)定
        2.3.5 活性污泥形態(tài)觀察
        2.3.6 CSTR反應(yīng)器產(chǎn)氣量和產(chǎn)氫量的測(cè)定
    2.4 活性污泥微生物群落組成測(cè)定
    2.5 產(chǎn)氫菌的分離和篩選
        2.5.1 樣品的采集及分離純化
        2.5.2 菌種篩選
        2.5.3 菌種培養(yǎng)方法
        2.5.4 菌種保存
    2.6 菌種鑒定
        2.6.1 菌種形態(tài)觀察
        2.6.2 菌種電鏡掃描觀察
        2.6.3 菌種染色鑒定
        2.6.4 最適初始pH值條件試驗(yàn)
        2.6.5 產(chǎn)氫菌種的分子生物學(xué)鑒定
    2.7 間歇實(shí)驗(yàn)裝置與材料
        2.7.1 間歇實(shí)驗(yàn)菌種
        2.7.2 間歇實(shí)驗(yàn)裝置
        2.7.3 間歇實(shí)驗(yàn)藥品及培養(yǎng)基含量
        2.7.4 氣體及氫氣含量測(cè)定
        2.7.5 比產(chǎn)氫率的計(jì)算
    2.8 產(chǎn)氫菌蛋白質(zhì)組學(xué)分析
        2.8.1 實(shí)驗(yàn)藥品
        2.8.2 產(chǎn)氫菌蛋白質(zhì)樣品制備
        2.8.3 SDS-PAGE檢測(cè)蛋白質(zhì)定量精準(zhǔn)度
        2.8.4 Trypsin酶切蛋白質(zhì)樣品
        2.8.5 iTRAQ試劑標(biāo)記多肽樣品
        2.8.6 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用鑒定分級(jí)多肽樣品
        2.8.7 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索與定量分析
        2.8.8 篩選可信定量結(jié)果及數(shù)據(jù)分析
        2.8.9 產(chǎn)氫菌蛋白質(zhì)功能分類
第3章 CSTR厭氧發(fā)酵制氫反應(yīng)器的啟動(dòng)運(yùn)行
    3.1 CSTR反應(yīng)器的啟動(dòng)運(yùn)行
        3.1.1 活性污泥顯微鏡下觀察結(jié)果
    3.2 CSTR反應(yīng)器的第一次啟動(dòng)運(yùn)行
        3.2.1 反應(yīng)器啟動(dòng)運(yùn)行參數(shù)控制
        3.2.2 第一次運(yùn)行階段pH值的變化
        3.2.3 第一次運(yùn)行階段COD的變化
        3.2.4 液相發(fā)酵產(chǎn)物含量分析
        3.2.5 反應(yīng)器啟動(dòng)運(yùn)行期間產(chǎn)氣量和產(chǎn)氫量的測(cè)定
        3.2.6 活性污泥沉降體積分析
        3.2.7 水力停留時(shí)間對(duì)COD去除率的影響
    3.3 CSTR反應(yīng)器的第二次啟動(dòng)運(yùn)行
        3.3.1 反應(yīng)器啟動(dòng)運(yùn)行參數(shù)控制
        3.3.2 第二次運(yùn)行階段pH值的變化
        3.3.3 第二次運(yùn)行階段COD的變化
        3.3.4 液相發(fā)酵產(chǎn)物含量分析
    3.4 CSTR反應(yīng)器中活性污泥群落特征分析
        3.4.1 第一次CSTR反應(yīng)器中活性污泥微生物群落特征分析
        3.4.2 第二次運(yùn)行階段活性污泥微生物群落特征分析
        3.4.3 兩次CSTR反應(yīng)器啟動(dòng)運(yùn)行活性污泥微生物群落特征差異分析
    3.5 本章小結(jié)
第4章 產(chǎn)氫菌種的分離和篩選
    4.1 產(chǎn)氫菌的分離和篩選
    4.2 產(chǎn)氫菌的菌種鑒定
    4.3 產(chǎn)氫菌WJY-29的形態(tài)特征
    4.4 產(chǎn)氫菌WJY-29的生理生化特性
    4.5 產(chǎn)氫菌WJY-29的間歇性實(shí)驗(yàn)
        4.5.1 初始pH值對(duì)產(chǎn)氫菌WJY-29產(chǎn)氣量和產(chǎn)氫量影響
    4.6 本章小結(jié)
第5章 拜氏梭菌WJY-29 產(chǎn)氫途徑蛋白質(zhì)組學(xué)分析
    5.1 研究對(duì)象選擇
    5.2 不同培養(yǎng)時(shí)間下產(chǎn)氫菌WJY-29差異表達(dá)蛋白質(zhì)分析
        5.2.1 差異表達(dá)蛋白質(zhì)功能分類
        5.2.2 差異表達(dá)蛋白質(zhì)豐度變化
        5.2.3 產(chǎn)氫相關(guān)差異蛋白質(zhì)聚類分析
    5.3 參與糖酵解途徑的蛋白質(zhì)
    5.4 參與細(xì)菌產(chǎn)氫代謝途徑蛋白質(zhì)
        5.4.1 丙酮酸脫羧相關(guān)蛋白質(zhì)
        5.4.2 NADH/NAD~+與產(chǎn)氫調(diào)節(jié)相關(guān)的蛋白質(zhì)
    5.5 拜氏梭菌WJY-29 厭氧發(fā)酵代謝途徑推斷
    5.6 本章小結(jié)
第6章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄A 英文標(biāo)注說明
附錄B 液相分級(jí)肽段色譜全圖
附錄C 液相分級(jí)肽段色譜主峰圖
攻讀學(xué)位期間取得的研究成果
致謝

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