基于絲網(wǎng)印刷電極(Screen printed carbon electrode,SPCE)的電化學(xué)免疫傳感器因造價(jià)低、可批量生產(chǎn)、免除復(fù)雜前處理、一致性好以及易于修飾等優(yōu)點(diǎn)大程度上挑戰(zhàn)了傳統(tǒng)固體電極在電化學(xué)免疫傳感器領(lǐng)域的研究與應(yīng)用。但在實(shí)際應(yīng)用中,SPCE面臨著諸如“絕對(duì)靈敏度好,相對(duì)靈敏度差,導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果平行性差,從而影響實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性”、“電極面積較小,導(dǎo)致抗體負(fù)載量較低,從而影響實(shí)驗(yàn)靈敏度”、“鮮有人關(guān)注電極的重復(fù)利用和再生”等問題。聚苯胺(PANI)是共軛聚合物典型代表之一,因其成本低廉、合成方便、熱穩(wěn)定性好、可快速摻雜和去摻雜等特點(diǎn),近年來(lái)在電化學(xué)免疫傳感器領(lǐng)域很受重視。本研究以PANI為基礎(chǔ),結(jié)合多種納米復(fù)合材料,選擇E.coli0157:H7為檢測(cè)模型,從電極表面修飾物的穩(wěn)定性和牢固性入手,制備出一種表面極其穩(wěn)定和導(dǎo)電性非常好的“活化電極”:SPCE-PANI-AuNPs,以改進(jìn)電化學(xué)免疫傳感器的檢測(cè)性能,特別是實(shí)現(xiàn)活化電極的再生和重復(fù)利用,達(dá)到高效、經(jīng)濟(jì)和環(huán)保的目的,并通過制備三種不同的免疫傳感器,以期通過研究提高、對(duì)比和選擇最佳,促進(jìn)SPCE和電化學(xué)免疫傳感器在食品安全領(lǐng)域的發(fā)展與應(yīng)用。具體研究?jī)?nèi)容如下:1.基于穩(wěn)定的還原態(tài)聚苯胺薄膜定量檢測(cè)E.coli O157:H7為解決SPCE修飾物牢固度低和穩(wěn)定性差的問題,本章采用恒電位法(potentiostatic method)在SPCE上電沉積PANI:苯胺單體在工作電極上分三個(gè)階段發(fā)生氧化聚合,生成PANI顆�；騊ANI膜,通過控制沉積時(shí)間和沉積電壓來(lái)控制PANI所處的反應(yīng)階段,從而控制PANI的分子結(jié)構(gòu)和形貌;再結(jié)合納米金(gold nanoparticles,AuNPs)的生物相容性,進(jìn)一步活化SPCE;最后從相對(duì)簡(jiǎn)單的“直接法”入手,構(gòu)建一種新型的E.coli O157:H7電化學(xué)免疫傳感器,實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)菌的定量檢測(cè)。在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下,電流強(qiáng)度與E.coli O157:H7菌液濃度的對(duì)數(shù)值呈線性關(guān)系,線性范圍為4.0×104至4.0×109CFU/mL,最低檢測(cè)限(LOD)為7.98 ×103 CFU/mL。在對(duì)奶粉樣品進(jìn)行的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)中,回收率在81.00%至95.50%之間。恒電位法電沉積得到的PANI薄膜不僅能夠提升電極表面的電子傳遞速率,還能提高電極比表面積,提供更多的活性位點(diǎn)以供AuNPs的連接。相較于通過循環(huán)伏安法(Cyclic Voltammetry,CV)沉積得到的PANI膜,恒電位法制備的PANI膜極其穩(wěn)定,可以經(jīng)受住強(qiáng)酸(HC1)、強(qiáng)堿(NaOH)以及超聲處理。AuNPs作為PANI和Ab的連接劑,不僅可以進(jìn)一步提高電極表面的導(dǎo)電能力,還能避免PANI(-NH3)和Ab(-COOH)直接相連時(shí)所需化學(xué)試劑(如EDC/NHS)導(dǎo)致Ab失活或自我交聯(lián)的問題。最重要的是,超穩(wěn)定的PANI為后續(xù)“活化電極的再生”打下基礎(chǔ)。2.基于穩(wěn)定聚苯胺薄膜和金鉑復(fù)合金屬納米粒子/中性紅功能化還原氧化石墨烯的可再生E.coli O157:H7電化學(xué)免疫傳感器研究為進(jìn)一步提高電化學(xué)免疫傳感器的靈敏度以及實(shí)現(xiàn)活化電極的再生,本章合成了金鉑復(fù)合金屬納米粒子(Au@Pt nanoparticles,Au@Pt);制備了中性紅(neutral red,NR)功能化的還原氧化石墨烯(rGO-NR),并通過靜電吸附作用將帶負(fù)電荷的Au@Pt吸附在rGO-NR上;再基于Au-N鍵結(jié)合原理將抗體(Ab2)吸附到Au@Pt上,制備得到捕獲探針rGO-NR-Au@Pt-Ab2-BSA;將該探針與活化電極SPCE-PANI-AuNPs共同孵育E.coli O157:H7形成夾心結(jié)構(gòu),實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)菌的定量檢測(cè);最后,通過10 min一定強(qiáng)度的超聲將夾心結(jié)構(gòu)除去,實(shí)現(xiàn)活化電極的再生。在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下,還原峰電流變化值(Reduction peak current change,AI)與E coli O157:H7 菌液濃度的對(duì)數(shù)值呈線性關(guān)系,線性范圍為8.9 ×103至8.9 ×109 CFU/mL,LOD為2.84 ×103 CFU/mL。在對(duì)市售豬肉和牛奶樣品進(jìn)行的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)中,回收率分別在80.90%至91.01%和88.76%至106.74%之間。5次再生的平均變異系數(shù)為8.47%,說(shuō)明傳感器至少可以重復(fù)使用5次。在該納米復(fù)合探針中,NR大大提升了 rGO的分散性,使其具有極高的比表面積;Au@Pt則因Au-N鍵使得探針具有極好的生物相容性,又因催化雙氧水(hydrogen peroxide,H2O2)的性能解決了酶?jìng)鞲衅髟谑褂眠^程中易失活的問題。相較于第一章,除了檢測(cè)限得到一定提升以外,最重要的是基于PANI的穩(wěn)定性實(shí)現(xiàn)了活化電極的再生,為下一章活化電極再生的進(jìn)一步深入研究打下基礎(chǔ)。3.高催化活性金鉑復(fù)合金屬納米粒子修飾的納米金摻雜聚苯胺微球?qū)稍偕鶨.coli O157:H7電化學(xué)免疫傳感器的改進(jìn)研究為縮短免疫傳感器的構(gòu)造時(shí)間,研制一種更安全快捷、綠色環(huán)保的新型探針,縮短活化電極再生的時(shí)間,提高活化電極再生的次數(shù),本研究用氯金酸(Chloroauric acid,HAuCl4)溶液做氧化劑,氧化前驅(qū)體苯胺,在鹽酸環(huán)境下制備了納米金摻雜的聚苯胺微球(AuNPs@PANI microspheres,AuNPs@PANI);再合成金鉑復(fù)合金屬納米粒子(Au@Pt nanoparticles),通過Au-N鍵吸附于AuNPs@PANI表面,孵育抗體(Ab2)后與活化電極形成夾心結(jié)構(gòu)。在對(duì)活化電極的再生處理中,縮短一半的超聲時(shí)間,并評(píng)估增加一倍的再生次數(shù)后活化電極的檢測(cè)性能。在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下,還原峰電流變化值(Reduction peak current change,ΔI)與E.coli O157:H7菌液濃度的對(duì)數(shù)值呈線性關(guān)系,線性范圍為8.9×104 至 8.9×109CFU/mL,LOD 為 3.0×103CFU/mL。在對(duì)市售牛奶樣品進(jìn)行的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)中,回收率在75.28%至105.62%之間。5 min的超聲時(shí)間可以實(shí)現(xiàn)對(duì)活化電極的再生,10次再生處理后,活化電極的檢測(cè)性能與初始無(wú)顯著性差異(p0.05)。相較于第二章,本章所構(gòu)建的傳感器主要有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn):(1)探針制備更經(jīng)濟(jì)高效、綠色安全。在制備rGO-NR-Au@Pt過程中.Hummer法合成氧化石墨烯工序耗時(shí)較長(zhǎng),且存在一定安全隱患。而制備AuNPs@PANI-Au@Pt可縮短約90%的耗時(shí),且反應(yīng)條件溫和、簡(jiǎn)單;(2)深入探究了電極的再生,將活化電極再生時(shí)間從10 min縮短至5 min,重復(fù)利用次數(shù)從5次增加至10次。綜上,本研究所構(gòu)建的三種E.coli O157:H7電化學(xué)免疫傳感器層層遞進(jìn),從電極表面修飾物的穩(wěn)定性切入,最終實(shí)現(xiàn)了電化學(xué)免疫傳感器的再生。其意義在于:(1)從工作效率出發(fā),制備活化電極耗時(shí)近24 h,而再生活化電極耗時(shí)僅需5 min,這將大大提高工作效率,節(jié)省工作時(shí)間;(2)從環(huán)保角度出發(fā),SPCE作為一種不易降解的塑料制品,大量一次性消耗必將帶來(lái)“白色污染”。實(shí)現(xiàn)SPCE的再生是符合綠色環(huán)�？沙掷m(xù)發(fā)展原則的;(3)從經(jīng)濟(jì)角度出發(fā),SPCE的單價(jià)雖然不高,但是積少成多也是十分可觀。從一次性使用變?yōu)?0次重復(fù)使用,直接將經(jīng)濟(jì)成本降至百分之十。雖然所構(gòu)建傳感器的LOD值均為103CFU/mL,看似并非十分敏感,但因源自3 μL的菌樣檢測(cè),第二章相當(dāng)于在直徑2 mm的SPCE表面檢測(cè)出了約20個(gè)菌,其中第三、四章均不到10個(gè),這已經(jīng)是一個(gè)十分靈敏的結(jié)果。
【學(xué)位單位】：浙江工商大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：TP212;TQ317;TB33
【部分圖文】：

Ｆｉｇ．?１－３?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｓｕｂｓｔｒａｔｅ?ｃａｔａｌｙｓｉｓ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ??ｓｔｒａｔｅｇｙ?ｉｎ?ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ??１．３．３．３底物循環(huán)放大策略??底物循環(huán)放大策略通常與酶催化放大技術(shù)聯(lián)用，是指電信號(hào)物質(zhì)在測(cè)試體系??中通過氧化還原作用循環(huán)反應(yīng)來(lái)提高檢測(cè)的靈敏度的方法［２２］。Ｔａｎｇ等［４２］用金納??米顆粒功能化的多壁碳納米管來(lái)標(biāo)記抗體形成夾心免疫模型。測(cè)試液中加入的對(duì)??硝基苯酚可在ＮａＢＨ４的作用下還原，在納米粒子的催化下，其產(chǎn)物與電極表面??的電化學(xué)活性物質(zhì)（Ｔｈｉｏｎｉｎｅ）產(chǎn)生了底物循環(huán)，放大電流，提高了檢測(cè)的靈敏度。??傳感器構(gòu)建步驟及檢測(cè)原理如圖１－４所示。??

??／??圖１－３免疫傳感器中底物催化放大策略??Ｆｉｇ．?１－３?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｓｕｂｓｔｒａｔｅ?ｃａｔａｌｙｓｉｓ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ??ｓｔｒａｔｅｇｙ?ｉｎ?ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ??１．３．３．３底物循環(huán)放大策略??底物循環(huán)放大策略通常與酶催化放大技術(shù)聯(lián)用，是指電信號(hào)物質(zhì)在測(cè)試體系??中通過氧化還原作用循環(huán)反應(yīng)來(lái)提高檢測(cè)的靈敏度的方法［２２］。Ｔａｎｇ等［４２］用金納??米顆粒功能化的多壁碳納米管來(lái)標(biāo)記抗體形成夾心免疫模型。測(cè)試液中加入的對(duì)??硝基苯酚可在ＮａＢＨ４的作用下還原，在納米粒子的催化下，其產(chǎn)物與電極表面??的電化學(xué)活性物質(zhì)（Ｔｈｉｏｎｉｎｅ）產(chǎn)生了底物循環(huán)，放大電流，提高了檢測(cè)的靈敏度。??傳感器構(gòu)建步驟及檢測(cè)原理如圖１－４所示。??輪參??ａｎｔｉ－．＼￥Ｐ??［ｈｉ〇ｘ?ｉｉ．ｉｕｘ??ＣＮＴ?ＡｕＮＰ－ｉｉ／ｉ／ｉ?ＡＦＰ?ＡｕＮＰ＾ｉ／ｉ／ｉ－ＡＦＰ??圖１－４免疫傳感器中底物循環(huán)放大策略應(yīng)用??９??

??中的電壓和時(shí)間是影響ＰＡＮＩ狀態(tài)和導(dǎo)電性的關(guān)鍵因素。從圖２－２?Ａ中可以看出，??沉積電壓在０．４４?Ｖ至０．５４?Ｖ之間時(shí)，隨著電壓的增大，ＰＡＮＩ的導(dǎo)電性也隨之??增大。當(dāng)沉積電壓達(dá)到０．５２?Ｖ之后，所得到的ＰＡＮＩ在表征時(shí)從原來(lái)的一對(duì)氧化??還原峰（０．２?Ｖ處，見圖２－２?Ｃ）變成了兩對(duì)峰（０．２?Ｖ處和０．５?Ｖ處，見圖２－２?Ｄ）。出??現(xiàn)在０．５?Ｖ處的峰介于還原態(tài)氧化為中間態(tài)的峰（０．２?Ｖ）和中間態(tài)進(jìn)一步氧化為氧??化態(tài)的峰（０．８?Ｖ）之間［６９］。這意味著在ＰＡＮＩ的沉積過程中，聚合物主鏈上發(fā)生了??相受損，有研宄者認(rèn)為這個(gè)介于兩者之間的氧化還原峰是苯醌／對(duì)苯二酚對(duì)。因??為在相對(duì)較高的電位下ＰＡＮＩ中亞胺基會(huì)過度氧化，亦或是ＰＡＮＩ中的吩嗪環(huán)發(fā)??生交聯(lián)［６４］。不同的沉積電壓可以得到不同狀態(tài)的ＰＡＮＩ，高電壓可以加速苯胺在??電解液中的聚合
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本文編號(hào)：2841373