慢性牙周炎是一種常見的慢性牙周疾病,而侵襲性牙周炎不同于慢性牙周炎,是一種快速急性發(fā)展的牙周疾病。雖然牙周炎并不致命,但可能會引起刷牙出血、牙齒松動、牙齒移位和口腔異味等現(xiàn)象,影響患者的生活質(zhì)量。目前主流的治療方法是基礎(chǔ)治療和抗生素聯(lián)合使用,但抗生素濫用導致耐藥菌株的出現(xiàn)已經(jīng)成為一個全球性的問題,一旦停止用藥,致病菌會重新定植在口腔。近年來,卵黃抗體廣泛應用于預防和治療由細菌、病毒或真菌等微生物引起的疾病。本文制備一種同時抗牙齦卟啉單胞菌和伴放線聚集桿菌的卵黃抗體,評價其生物活性,制作成為合適的劑型,為防治牙周疾病探索新方法。血平板瓊脂培養(yǎng)基上觀察牙齦卟啉單胞菌和伴放線聚集桿菌的菌落特征,用革蘭氏染色、掃描電鏡和透射電鏡觀察細菌形態(tài)特征。用二株牙周炎致病菌免疫產(chǎn)蛋母雞,收集雞蛋蛋黃液,通過水稀釋法或聚乙二醇6000沉淀法提取卵黃抗體,使用硫酸銨鹽析或硫酸鈉鹽析提純卵黃抗體。提取物中蛋白質(zhì)的含量用考馬斯亮藍染色法檢測,卵黃抗體的相對分子量和純度使用SDS-PAGE分析,采用ELISA檢測卵黃抗體的效價和交叉反應,間接免疫熒光和蛋白質(zhì)免疫印跡實驗分析卵黃抗體的特異性,結(jié)晶紫染色定量法檢測特異性卵黃抗體對牙齦卟啉單胞菌和伴放線聚集桿菌生物被膜形成的抑制作用。通過免疫電鏡和共凝集實驗分析卵黃抗體可能的作用機制。最后探討卵黃抗體在漱口水中的穩(wěn)定性。結(jié)果表明細菌的菌落特征和形態(tài)符合報道。水提取或聚乙二醇提取卵黃抗體的方法可行,其中聚乙二醇提取法提取的復合型卵黃抗體效價高,對牙齦卟啉單胞菌的效價峰值為1:10240,對伴放線聚集桿菌的效價峰值為1:5120,在初次免疫后的48天達到效價峰值,持續(xù)15天,與14株其他種屬細菌的交叉反應性較弱。間接免疫熒光和免疫印跡實驗表明,卵黃抗體與抗原的結(jié)合具有較高的特異性。卵黃抗體以劑量依賴性的方式抑制細菌生物被膜的形成(p0.05),免疫電鏡和共凝集實驗表明卵黃抗體可特異性結(jié)合并作用于細菌細胞壁,使產(chǎn)生共凝集現(xiàn)象。穩(wěn)定性評價結(jié)果表明,卵黃抗體具有優(yōu)良的穩(wěn)定性,能夠較好的在漱口水中保持活性。本文制備一種高效價、高純度、高特異性的復合型卵黃抗體,能夠顯著抑制牙齦卟啉單胞菌和伴放線聚集桿菌形成生物被膜。研究成果為治療牙周疾病尋找新的思路,也為卵黃抗體應用于日化產(chǎn)品中提供參考。
【學位單位】：廣東工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：TQ464
【部分圖文】：

圖 1-1 IgY 和 IgG 的結(jié)構(gòu)圖Fig. 1-1 Molecular structure of IgY and IgG的生物學特性 至 9， 60℃以下的溫度較穩(wěn)定，抗胰蛋白酶和糜蛋白酶冷凍干燥或噴霧干燥既能夠保持活性又有利于其長期儲存添加一定的物質(zhì)均能提高其穩(wěn)定性。如在 pH 為 3 時，溶液性幾乎不受損。

1.5 本文的研究意義及主要工作本研究的目的是制備抗牙齦卟啉單胞菌和伴放線聚桿菌的復合型 IgY，為 IgY 應用于治療牙周疾病提供實驗和理論依據(jù)，也為 IgY 應用于日化用品中提供參考。本研究工作主要包括下面幾個部分：培養(yǎng)牙周炎致病菌 Pg 和 Aa，將二種細菌相混合，免疫產(chǎn)蛋母雞，獲得復合型 IgY，分離提純獲得高純度的 IgY。體外測特異性 IgY 的生物活性，包括 ELISA，抑制細菌生物被膜實驗，間接免疫熒光等。通過共凝集實驗和免疫電鏡實驗分析 IgY 的作用機制。體外研究 IgY 的穩(wěn)定性，并將其與現(xiàn)有的漱口水液混合，探究其應用于產(chǎn)品中的可能性，通過 ELISA 實驗來研究其在漱口水中的穩(wěn)定性。本研究整體思路如下圖 1-2 所示：

37 ℃、5 %二氧化碳條件下進行培養(yǎng)。Aa 的固體培養(yǎng)則繼續(xù)用接種環(huán)在血瓊脂培養(yǎng)基上或者自制血瓊脂平板固體培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)。細菌的液體培養(yǎng)為，將固體培養(yǎng)的細菌，在超凈工作臺上接種到 TSB 液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 24h 后離心收集。為防止細菌菌種丟失，采用甘油凍存管保存菌種于-80 ℃冰箱中，甘油的最終濃度為 20-25 %。Pg 是嚴格厭氧細菌，培養(yǎng)比 Aa 復雜。首先是固體培養(yǎng)，固體培養(yǎng)基選血瓊脂平板培養(yǎng)基或者自制的含血大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基，接種完成后放入?yún)捬醮�，同時快速加入?yún)捬醍a(chǎn)氣袋和厭氧指示劑并合上厭氧產(chǎn)氣袋的開口處，避免漏氣，能明顯感覺到厭氧產(chǎn)氣袋發(fā)熱的現(xiàn)象，是厭氧袋中的化學物質(zhì)消耗厭氧產(chǎn)氣袋中的氧氣，觀察厭氧指示劑的顏色，判斷厭氧袋中是否處于無氧狀態(tài)。于生化培養(yǎng)箱 37℃厭氧條件下培養(yǎng) 4 至 7 天�？稍谘桨宄善放囵B(yǎng)基上觀察到特征性黑色菌落。使用厭氧液體培養(yǎng)基培養(yǎng) Pg，首先制作厭氧液體培養(yǎng)基，如下圖 2-1 所示，，本文選用的是自制含特殊營養(yǎng)物質(zhì)的 TSB 液體培養(yǎng)基。

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本文編號：2808144