表面活性劑可以作為提高乳化性、溶解性以及分散性的物質,其應用可以覆蓋我們的工業(yè)生產如化工產業(yè)和我們的日常生活如食品、藥物等各個方面。特別地,近年來由微生物產生的生物表面活性劑,由于其優(yōu)異的表面活性、良好的環(huán)境友好性和可降解性而受到持續(xù)關注�；碧侵鳛槠渲幸环N重要的糖脂類生物表面活性劑而被廣泛用于食品行業(yè)、日化行業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)以及環(huán)境保護等諸多領域。目前,較高的生產成本及較低的產量成為制約槐糖脂生產應用的兩個主要因素。因此,降低其生產成本并提高其產量,研究者們開展了大量研究工作。本論文在降低槐糖脂的生產成本方面主要從對其發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化和對其生產菌株進行遺傳改造兩方面進行了研究。本論文的主要研究內容及結果如下:1.球擬假絲酵母產槐糖脂的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化微生物的生長和繁殖需要從基質中連續(xù)吸收營養(yǎng)物質以獲取能量并合成代謝物。為了研究微生物的生長繁殖以及代謝物的合成,首先要了解微生物的營養(yǎng)需求和培養(yǎng)條件,以便有效控制微生物的生長繁殖和產物代謝,達到工業(yè)化生產的目的。因此,研究微生物的營養(yǎng)特性和培養(yǎng)條件,進行發(fā)酵培養(yǎng)基的有效優(yōu)化是實現(xiàn)微生物發(fā)酵產業(yè)化的一個關鍵因素。發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化路線一般分為兩步,首先優(yōu)先確定主要影響因素,然后通過多因子實驗進一步優(yōu)化培養(yǎng)基各成分的最適濃度。在本論文采用Plackett-Burman設計和中心組合設計對球擬假絲酵母產槐糖脂的發(fā)酵培養(yǎng)基進行了有效優(yōu)化,優(yōu)化后的槐糖脂產量由53.2 g/L增加到72.2 g/L,產量提高了約38%。2.透明顫菌血紅蛋白基因在球擬假絲酵母中的功能研究好氧微生物在發(fā)酵的過程中,必須持續(xù)不斷通入無菌空氣,氧氣先由氣相溶解到液相,再為細胞所吸收,用于菌體生長以及代謝產物的合成。因此,發(fā)酵液中的溶解氧水平對細胞的生長和代謝物的合成具有重要的生理作用。目前發(fā)酵過程常用的氧控制方法有:(1)提高設備供氧能力,如提高攪拌轉速等;(2)增加空氣總壓,或者是進行富氧通氣,從而提高氧分壓;(3)控制菌體對氧的消耗速率。這些方法往往對設備要求高,用于槐糖脂的工業(yè)化生產中導致成本較高。值得注意的是,目前幾乎沒有任何關于以基因工程技術對產槐糖脂菌株的攝氧能力進行菌種改良的報道。本論文通過遺傳操作將透明顫菌血紅蛋白基因vgb整合到球擬假絲酵母基因組中,構建了一株對氧氣利用能力大幅提高的重組菌株。在搖瓶發(fā)酵實驗中,不同的轉速條件下(110 rpm,150 rpm,200 rpm),槐糖脂的產量分別提高了 18.4%。,65%,18.2%。在1L發(fā)酵罐的發(fā)酵實驗中,不同轉速條件下(400 rpm,600 rpm),槐糖脂的產量分別提高了24%,33%。重組菌株在400 rpm條件下的槐糖脂產量接近于野生型菌株在600 rpm條件下的產量,顯示出極好的工業(yè)應用前景。3.利用木質纖維素原料產槐糖脂系列工程菌株的構建目前,未能實現(xiàn)槐糖脂大規(guī)模工業(yè)化的主要原因之一是生產成本較高。發(fā)酵過程中需要包括親水性碳源(葡萄糖)和疏水性碳源(脂肪酸)在內的兩種碳源,其中親水性碳源葡萄糖的用量達到80 g/L。木質纖維素是由約14,000個左右的葡萄糖單元組成的長鏈β-D-葡萄糖,是自然界中含量最為豐富的一種可再生資源。以纖維素資源取代糖類是目前發(fā)酵工業(yè)上降低原料成本的一種重要的方式,然而產槐糖脂的球擬假絲菌株不能直接利用纖維素原料,如何使槐糖脂產生酵母能夠利用生產質資源直接產生槐糖脂就成一個挑戰(zhàn)。在本文中,通過基因工程技術構建了表達草酸青霉的主要纖維素酶基因eg1,eg2,bg1,cbh 的系列球擬假絲酵母重組菌株EG1,EG2,BGL1以及CBH2。為了使各基因協(xié)同發(fā)揮作用,我們采用了菌株共培養(yǎng)的策略,以1%的磷酸膨脹纖維素為底物進行了發(fā)酵實驗。結果表明,通過共培養(yǎng)重組菌株降解磷酸膨脹纖維素所產生的槐糖脂總量是野生型菌株的2.6倍,表明該系列重組菌株水解木質纖維生產槐糖脂的優(yōu)勢,初步實現(xiàn)了利用木質纖維素原料生產槐糖脂的設想。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：TQ423;TQ920.6
【部分圖文】：

邐Ｓ３９６．Ｓ４邐１５逡逑圖２－１邋ＰＢＤ實驗結果方差分析逡逑變量影響產量的Ｐａｒｅｔｏ圖更加直觀地展示了邋ＰＢＤ方差分析的結果，如圖２－２所逡逑示，空心柱表示單因素對槐糖脂產量的影響，實心柱則表示各因素之間的交互作逡逑用。由圖２－２看出８和０，即７￡３５１６NB加（：１和燦２＾＞0４１２出0對槐糖脂的生產有顯逡逑著影響，且各個因素之間沒有明顯的交互作用。逡逑３邋的邐Ｓｏｎｆｅｒｒｏｒａ邋Ｕｒｏｔ邋３．３６４２２逡逑３．５６邋—逡逑已逡逑３．１６邋—邋ＩＴＴ逡逑２．７７－邐Ｄ逡逑ｒ＝ｒ逡逑２－３７邋—邐ｐ邐ｔ－Ｖ＾ｅ邐Ｕｎｒｔ邋２２Ｓ２＼ｔ逡逑１．９８邋一邐＂逡逑１．５８邋—邐一￣｜邐ｒ逡逑ｎ邋ｎ邋ｎ逡逑１．１９邋—邐｜逡逑ＥＵｕｕｌｌｌｙｉｎｎｉｉｉ＞．逡逑ｉ邐ｉ邐ｉ邐ｉ邐ｉ邐ｉ邐ｉ邐ｉ邐ｉ邐ｉ邐ｉ邐ｉ邐ｉ邐ｉ邐ｉ逡逑１邐２邐３邐４邐５邐６邐７邐８邐９邐１０邐１１邐１２邐１３邐１４邐１５逡逑圖２－２變量影響槐糖脂產量的Ｐａｒｅｔｏ圖逡逑１８逡逑

２．２．２兩因素五水平中心組合實驗逡逑通過兩因素五水平的中心組合實驗確定顯著影響因素的最優(yōu)水平，實驗設計逡逑及結果見表２－３。五個水平１￣５分別以－ａ，－１，０，邋１，邋ａ來表示，由圖２－３所示，逡逑Ｎａ２ＨＰ0４邋１２Ｈ２０在第一個水平（－ａ），ｙｅａｓｔ邋ｅｘｔｒａｃｔ在２？３水平？０）時，槐糖脂產量逡逑較高，結合圖２－４的產量３Ｄ直觀展示圖可以看出，ｙｅａｓｔ邋ｅｘｔｒａｃｔ在第二個水平（－１），逡逑Ｎａ２ＨＰ0４ｌ２Ｈ２0在第一個水平（－ａ）時，槐糖脂產量最高，即ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃ＾２．５ｇ／Ｌ，逡逑Ｎａ２ＨＰ０（１２Ｈ２０�。埃卞澹纾虝r，槐糖脂的產量最高。逡逑？．ｌｌｒＪｒ１１：．，邋？ｏ－ｉｏ逡逑■邋ｊｏ邋？逡逑Ｘ｜邐７邐３邐４邐５逡逑圖２－３邋Ｙｅａｓｔ邋ｅｘｔｒａｃｔ和Ｎａ２ＨＰ0４．１２Ｈ２０對球擬假絲酵母產槐糖脂影響的等值線圖逡逑＿＿逡逑圖２－４槐糖脂產量分布的３Ｄ展示圖逡逑２．２．３發(fā)酵驗證優(yōu)化培養(yǎng)基逡逑將球擬假絲酵母分別接種初始發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖８．０％，油酸６．０％邋（ｖ／ｖ），逡逑酵母粉０．３％，邋ＫＨ２Ｐ0４0．１０％，Ｎａ２ＨＰ0４．１２Ｈ２Ｏ０．１％，ＭｇＳ０４．７Ｈ２0０．０５％（ｗ／ｖ））逡逑和優(yōu)化后的培養(yǎng)基（葡萄糖８．０％

２．２．２兩因素五水平中心組合實驗逡逑通過兩因素五水平的中心組合實驗確定顯著影響因素的最優(yōu)水平，實驗設計逡逑及結果見表２－３。五個水平１￣５分別以－ａ，－１，０，邋１，邋ａ來表示，由圖２－３所示，逡逑Ｎａ２ＨＰ0４邋１２Ｈ２０在第一個水平（－ａ），ｙｅａｓｔ邋ｅｘｔｒａｃｔ在２？３水平？０）時，槐糖脂產量逡逑較高，結合圖２－４的產量３Ｄ直觀展示圖可以看出，ｙｅａｓｔ邋ｅｘｔｒａｃｔ在第二個水平（－１），逡逑Ｎａ２ＨＰ0４ｌ２Ｈ２0在第一個水平（－ａ）時，槐糖脂產量最高，即ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃ＾２．５ｇ／Ｌ，逡逑Ｎａ２ＨＰ０（１２Ｈ２０�。埃卞澹纾虝r，槐糖脂的產量最高。逡逑？．ｌｌｒＪｒ１１：．，邋？ｏ－ｉｏ逡逑■邋ｊｏ邋？逡逑Ｘ｜邐７邐３邐４邐５逡逑圖２－３邋Ｙｅａｓｔ邋ｅｘｔｒａｃｔ和Ｎａ２ＨＰ0４．１２Ｈ２０對球擬假絲酵母產槐糖脂影響的等值線圖逡逑＿＿逡逑圖２－４槐糖脂產量分布的３Ｄ展示圖逡逑２．２．３發(fā)酵驗證優(yōu)化培養(yǎng)基逡逑將球擬假絲酵母分別接種初始發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖８．０％，油酸６．０％邋（ｖ／ｖ），逡逑酵母粉０．３％，邋ＫＨ２Ｐ0４0．１０％，Ｎａ２ＨＰ0４．１２Ｈ２Ｏ０．１％，ＭｇＳ０４．７Ｈ２0０．０５％（ｗ／ｖ））逡逑和優(yōu)化后的培養(yǎng)基（葡萄糖８．０％

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本文編號：2808098