【摘要】：微生物源谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(Microbial Transglutaminase,MTG)在農(nóng)產(chǎn)品加工產(chǎn)業(yè)中是一種非常重要的酶制劑,廣泛應(yīng)用于乳品、海鮮、肉類、面點(diǎn)、豆制品、可食用膜等多種產(chǎn)品的加工生產(chǎn)中。目前,MTG來(lái)源于天然菌種的發(fā)酵或MTG基因在細(xì)菌、酵母菌中的重組表達(dá)。天然菌株發(fā)酵可以直接獲得有活性的酶,但是發(fā)酵周期長(zhǎng)且工藝流程復(fù)雜;重組菌株發(fā)酵周期短、成分簡(jiǎn)單,但活性表達(dá)需要選擇適合的表達(dá)策略,否則容易形成包涵體或無(wú)法獲得有活性產(chǎn)物。為了解決以上問題,本研究以實(shí)驗(yàn)室前期篩選得到的兩株具有MTG活性的放線菌菌株107.3和109.5為研究對(duì)象,從菌種選育、下游處理?xiàng)l件摸索、異源表達(dá)機(jī)制探索、酶分子改造及特性表征等幾方面著手,獲得主要研究結(jié)果如下:MTG產(chǎn)生菌的系統(tǒng)發(fā)育研究。經(jīng)過16S rDNA序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建以及形態(tài)觀察,確定菌株107.3為吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)近似種,吸水鏈霉菌是鏈霉菌屬中目前已知的MTG高產(chǎn)菌種之一;菌株109.5為嗜角蛋白擬無(wú)枝酸菌(Amycolatopsis keratinophila)的近似種,其MTG活性尚未見報(bào)道。菌株109.5的誘變育種以及MTG的濃縮初提。確定了菌株109.5的最適種子培養(yǎng)基為葡萄糖10.0 g/L,蛋白胨10.0 g/L,酵母粉10.0 g/L,MgSO_4·7H_2O 0.5 g/L,K_2HPO_4 0.7 g/L,KH_2PO_4 0.3 g/L,pH7.0;發(fā)酵條件為30℃,200 r/min種子培養(yǎng)30h后,以0.5%接種量轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基,發(fā)酵70 h。先后采用紫外線誘變、羥胺誘變和多功能等離子體誘變系統(tǒng)(MPMS,multifunctional plasma mutagenesis system)對(duì)菌株109.5進(jìn)行了誘變,并通過正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖25 g/L,蛋白胨35 g/L,酵母粉1 g/L,NaCl 2 g/L,pH 7.2;使突變株P(guān)M-66的酶活力達(dá)到1.421±0.009 U/mL,比野生型菌株提高了3.55倍。建立了基于Image J圖像灰度分析的固體培養(yǎng)基半定量篩選突變株的方法,實(shí)現(xiàn)了突變株的高通量篩選,也為其它同樣不便于進(jìn)行液體比色的菌株篩選提供了新思路。采用雙水相萃取(ATPE,aqueous two phase extracton)的方法對(duì)突變株P(guān)M-66發(fā)酵液中的MTG進(jìn)行了濃縮初提,確定了最適雙水相系統(tǒng)ATPS(aqueous two phase system)為26%PEG1000-19%(NH_4)_2SO_4-5%NaCl,萃取體系pH值為6.0,萃取的產(chǎn)率為86.51%,比酶活0.83U/mg,萃取后向PEG相中添加9%的(NH_4)_2SO_4可以獲得酶的沉淀。將雙水相萃取法應(yīng)用于擬無(wú)枝酸菌發(fā)酵液MTG的初提尚未見報(bào)道。菌株107.3的MTG基因克隆表達(dá)與分子改造。首先,菌株107.3 MTG基因被克隆并轉(zhuǎn)化到了大腸桿菌(Escherichia coli)中,在IPTG(異丙基硫代半乳糖苷,isopropylβ-D-thiogalactoside)的誘導(dǎo)下,重組大腸桿菌的酶活力為0.372±0.008U/mL;鎳離子親和層析純化后,重組MTG最適溫度35℃,最適pH7;Na~+、K~+對(duì)酶活有少許促進(jìn)作用,Zn~(2+)、Cu~(2+)、Mg~(2+)、Fe~(2+)、Mn~(2+)則對(duì)酶活有不同程度的抑制作用,Ca~(2+)對(duì)酶活幾乎沒有影響。其次,構(gòu)建并成功表達(dá)了14種菌株107.3 MTG的不同形式突變體,多數(shù)突變體的的催化活性或穩(wěn)定性優(yōu)于未突變酶,Y133F突變體的比活力最高;在Y133位點(diǎn)進(jìn)一步構(gòu)建并表達(dá)了8種氨基酸替換突變體,其中6種突變體的比活力都高于未突變酶。由此說(shuō)明酶分子改造的有益突變位點(diǎn)主要集中于分子N端和靠近酶活性裂縫的周圍區(qū)域;Y133是吸水鏈霉菌MTG分子中的有益突變位點(diǎn)。最后,為了研究MTG前導(dǎo)片段的功能,吸水鏈霉菌MTG基因與茂源鏈霉菌(Streptomyces mobaraense)MTG基因分別被轉(zhuǎn)化到畢赤酵母(Pichia pastoris)菌株X33中,采用了前導(dǎo)片段與成熟酶分開或融合兩種表達(dá)形式。表達(dá)融合吸水鏈霉菌MTG前導(dǎo)片段與成熟酶的重組酵母菌株6711在1.5%甲醇誘導(dǎo)下,30℃發(fā)酵96 h,酶活力為0.200±0.005 U/mL。單獨(dú)表達(dá)前導(dǎo)片段與成熟酶的重組菌株均未檢測(cè)到酶活。說(shuō)明前導(dǎo)片段與成熟酶分別表達(dá)不能使成熟酶進(jìn)行正確的折疊,只有在正確切割的前提下,前導(dǎo)片段才可以幫助成熟酶折疊為正確的空間結(jié)構(gòu),表現(xiàn)出活性。
【學(xué)位授予單位】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TQ925;Q78
【圖文】：

微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的發(fā)酵與異源表達(dá)研究1 引言酶氨酶的微生物 酶 （ EC 2.3.2.13 ； Transglutaminase ； Protein氨酰胺肽:胺 γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶），也稱谷氨酰胺轉(zhuǎn)），負(fù)責(zé)催化多肽和蛋白質(zhì)中谷氨酰胺殘基的 γ-氨甲；當(dāng)賴氨酸殘基的 ε-氨基為�；荏w時(shí)，分子內(nèi)或當(dāng)水為�；荏w時(shí)，谷氨酰胺殘基會(huì)脫去酰胺基成為①

微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的發(fā)酵與異源表達(dá)研究赤酵母[108]pro 與 MTG 插入 Kex2 酶識(shí)別位點(diǎn) 可溶 Kex2 酶切 0.270假絲酵母[108]α 因子分別與 pro和 MTG融合表達(dá) 可溶 無(wú)需 0.338赤酵母[109]α 因子分別與 pro和 MTG融合表達(dá) 可溶 無(wú)需 0.180耶氏酵母[110]pro 與 MTG 插入宿主 Kex2 酶識(shí)別位點(diǎn) 可溶 無(wú)需 5.260共表達(dá) pro-MTG與蛋白酶 TAMEP 可溶 無(wú)需 6.770——，文獻(xiàn)未報(bào)道。Not reported. MTG 分子改造策略了選擇合適的異源宿主菌株以及進(jìn)一步研究宿主中 MTG的表達(dá)機(jī)制，對(duì) MTG進(jìn)行各種造，也是提升酶的催化活性或熱穩(wěn)定性的一條重要途徑。產(chǎn)自茂源鏈霉菌的 MTG的基本圖 1-2所示[111]。

微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的發(fā)酵與異源表達(dá)研究果與討論兩株放線菌的形態(tài)特征線菌菌株 107.3 與 109.5 在高氏培養(yǎng)基上均為白色菌落，菌落表面干燥呈粉末狀，刮取。圖 2-1 為高氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng) 3 d 的菌落圖片，菌株 107.3 菌落厚且凸起，間可見龜裂，或有細(xì)小水滴；菌株 109.5菌落薄而扁平，邊緣呈細(xì)小絨毛狀。在液體培養(yǎng) 2 d 后（圖 2-2），兩菌株在顯微鏡下均為菌絲體，帶或不帶分枝，菌株 107交錯(cuò)，菌株 109.5菌絲短，多斷裂為菌絲段。

【參考文獻(xiàn)】

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