【摘要】：茶褐素(TBs)是一類銹褐色且具有酚類性質(zhì)的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的高聚物,具有降血糖、降脂減肥等多種生物活性,對(duì)骨肉瘤和肺癌表現(xiàn)良好的抗癌作用,但對(duì)一些常見多發(fā)癌癥(如乳腺癌等)的研究尚未見報(bào)道。茶褐素在普洱熟茶中含量較高,而普洱茶發(fā)酵周期較長,導(dǎo)致茶褐素生產(chǎn)效率低,限制了茶褐素資源的開發(fā)利用。因此,尋找高效生產(chǎn)茶褐素的方式并全面了解其生物活性成為研究熱點(diǎn)。本文篩選了產(chǎn)茶褐素的優(yōu)勢(shì)菌,并優(yōu)化其液態(tài)發(fā)酵工藝,顯著提高了茶褐素生產(chǎn)效率,并對(duì)液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的茶褐素的化學(xué)組成及生物活性進(jìn)行了分析,旨在為開發(fā)具有良好抑菌、抗氧化和抗乳腺癌生物活性的茶褐素相關(guān)功能性食品提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。取得的主要研究結(jié)果如下:(1)產(chǎn)茶褐素優(yōu)勢(shì)菌的篩選鑒定及液態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化。通過篩選獲得3株高產(chǎn)茶褐素優(yōu)勢(shì)菌,分別為杰丁畢赤酵母、黑曲霉、煙曲霉,并優(yōu)化了優(yōu)勢(shì)菌高效生產(chǎn)茶褐素的液態(tài)發(fā)酵條件,即發(fā)酵溫度37℃、搖床轉(zhuǎn)速180 rpm,當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為5 d時(shí),茶褐素TBs_(黑曲霉)、TBs_(煙曲霉)和TBs_(杰丁畢赤酵母)的含量分別達(dá)到16.29%、27.11%和9.29%,其中,茶褐素TBs_(黑曲霉)和TBs_(煙曲霉)的含量大大超過了傳統(tǒng)渥堆發(fā)酵的水平,且較渥堆發(fā)酵時(shí)間顯著縮短。(2)優(yōu)勢(shì)菌液態(tài)發(fā)酵茶褐素的化學(xué)組成比較分析。與傳統(tǒng)渥堆態(tài)發(fā)酵所得的茶褐素相比,優(yōu)勢(shì)菌液態(tài)發(fā)酵所得的茶褐素中總酚含量明顯較高(P0.05),而總糖、蛋白質(zhì)含量因菌株不同而有所差異。紫外可見光譜和紅外光譜分析發(fā)現(xiàn),液態(tài)發(fā)酵與渥堆發(fā)酵茶褐素具有相似的官能團(tuán),且均為多羥基酚類物質(zhì)。(3)液態(tài)發(fā)酵茶褐素的生物活性評(píng)價(jià)。(1)最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn),在0.5~8mg/mL的濃度范圍內(nèi),TBs_(杰丁畢赤酵母)對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的抑菌能力強(qiáng)于TBs_(煙曲霉)和TBs_(黑曲霉)。(2)體外抗氧化實(shí)驗(yàn)測(cè)定茶褐素的還原力和DPPH自由基清除能力,發(fā)現(xiàn)液態(tài)發(fā)酵茶褐素均具有抗氧化活性,且存在濃度依賴效應(yīng),當(dāng)濃度為0.5 mg/mL時(shí),還原力大小順序?yàn)門Bs_(杰丁畢赤酵母)TBs_(煙曲霉)TBs_(黑曲霉),在10~60μg/mL范圍內(nèi),TBs_(杰丁畢赤酵母)對(duì)DPPH自由基的清除能力顯著高于TBs_(煙曲霉)和TBs_(黑曲霉)(P0.05)。(3)進(jìn)一步研究液態(tài)發(fā)酵茶褐素對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),TBs_(煙曲霉)、TBs_(杰丁畢赤酵母)和TBs_(黑曲霉)均對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖有抑制作用,且呈時(shí)間和劑量依賴效應(yīng),其中,TBs_(黑曲霉)對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制效果最強(qiáng)。進(jìn)一步通過細(xì)胞形態(tài)觀察、DAPI核染色和線粒體膜電位檢測(cè)TBs_(黑曲霉)對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響,發(fā)現(xiàn)TBs_(黑曲霉)是通過誘導(dǎo)線粒體膜電位降低,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡線粒體通路的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,不同優(yōu)勢(shì)菌液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的茶褐素具有不同的生物活性,因此,可針對(duì)不同的應(yīng)用需求進(jìn)行相應(yīng)的茶褐素液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)和功能食品開發(fā)。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TQ920.1;TS218
【圖文】：

華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文隨著酸性增強(qiáng)而降低。董文明等[11]對(duì)普洱茶茶褐素進(jìn)行甲醇-水梯度分離、薄層色譜以及膜透析技術(shù)處理，分離純化出兩種物質(zhì)，進(jìn)一步采用紅外光譜、高效液相色譜、核磁共振和 GC-MS等結(jié)構(gòu)分析方法進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化合物 I 為多羥基酚類高分子物質(zhì)，化合物II 可能為磷酸甘酯鈉。譚超等[5]利用膜透析技術(shù)對(duì)茶褐素大小分級(jí)，通過原子力顯微技術(shù)對(duì)不同分子量的茶褐素觀察，發(fā)現(xiàn)粒子形貌并不均一，進(jìn)一步對(duì)其酸水解，對(duì)去除多糖和蛋白后的黑色沉淀物質(zhì)進(jìn)行 CP-GC/MS 分析，鑒定出可能存在的化合物類型（圖 1-1），其中，黑色沉淀物質(zhì)中氟是如何與大分子色素結(jié)合還需進(jìn)一步研究。

華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文株，進(jìn)行多次平板劃線純化，將純化得到的菌株標(biāo)號(hào)為 sc1~9，分別接種至液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。根據(jù)目前研究進(jìn)展，形成茶褐素的前體物質(zhì)主要是茶類物質(zhì)，在渥堆發(fā)酵過程中茶多酚含量逐漸下降，并主要轉(zhuǎn)化成茶褐素。因此茶多酚含量為依據(jù)進(jìn)行初篩，測(cè)定各發(fā)酵液中茶多酚含量，結(jié)果如圖 2-1 所示。

圖 2-2 不同微生物對(duì)茶褐素含量的影響Fig.2-2 Effects of different microorganis on concentrations of theabrownins 為不接種微生物對(duì)照組，sc3、sc5、sc6、sc7、sc8 和 sc9 為實(shí)驗(yàn)組。星號(hào)表示實(shí)驗(yàn)組相比于 CK顯著性差異（P < 0.05），n = 3。產(chǎn)茶褐素優(yōu)勢(shì)菌株的鑒定1 菌株形態(tài)學(xué)觀察1）將菌株 sc5 接種至 PDA 固體平板上，28℃培養(yǎng) 4 天，觀察菌落形態(tài)2-3 所示。PDA 平板上菌株 sc5 菌落呈圓形，邊緣整齊，菌落乳白色，滑濕潤。進(jìn)一步利用顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞呈橢圓形，以多邊出芽方殖。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征初步推斷 sc5 為酵母菌。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2797911