【摘要】：心腦血管疾病作為死亡率超過癌癥的一類疾病,近幾年來廣受人們關(guān)注。洛伐他汀是從土曲霉中分離得到的一種聚酮類藥物,被廣泛作為降血脂藥物使用。與洛伐他汀相比,辛伐他汀藥用價(jià)值更高、副作用更小,具有巨大的藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。莫納克林J是洛伐他汀天然生物合成途徑中一個(gè)重要的中間體,也是辛伐他汀化學(xué)半合成的關(guān)鍵中間體。隨著合成生物學(xué)的發(fā)展,已有報(bào)道在酵母細(xì)胞中異源合成莫納克林J和洛伐他汀,及在大腸桿菌中轉(zhuǎn)化為辛伐他汀。在底盤宿主中異源表達(dá)目標(biāo)基因,易對(duì)宿主造成生長、代謝壓力,同時(shí)活性化合物的過多積累也會(huì)對(duì)細(xì)胞造成毒性。本課題組前期在畢赤酵母中已實(shí)現(xiàn)莫納克林J和洛伐他汀的異源合成,同時(shí)發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)物異源合成對(duì)底盤宿主產(chǎn)生不利影響。本課題主要研究不同來源的真菌他汀泵蛋白對(duì)洛伐他汀及莫納克林J的轉(zhuǎn)運(yùn)作用,為大規(guī)模異源生產(chǎn)他汀類藥物分子提供新的參考。首先,本文以文獻(xiàn)報(bào)道的柑橘青霉MlcE蛋白為參考進(jìn)行BLAST檢索,發(fā)現(xiàn)在洛伐他汀的天然生產(chǎn)宿主——野生型土曲霉NIH2624菌株中,存在與MlcE蛋白有69%相似性的假定蛋白,其功能注釋為類似于外排泵,本文將其命名為TapA蛋白。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)與MlcE蛋白相似性較高的還有兩種他汀泵蛋白,分別為Lovl蛋白和MokI蛋白。本文比較了各泵蛋白的氨基酸序列差異,推測(cè)出其保守功能域,并在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中比較了四種他汀泵蛋白在洛伐他汀耐受和莫納克林J轉(zhuǎn)運(yùn)方面發(fā)揮的功能差異。其次,以他汀泵蛋白TapA為研究對(duì)象,從不同角度分析TapA蛋白對(duì)于洛伐他汀的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。亞細(xì)胞定位顯示TapA定位在細(xì)胞膜上,有助于蛋白發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)功能。野生型酵母GS115菌株耐受洛伐他汀的濃度不高于0.5 mmol/L,而TapA蛋白過表達(dá)酵母菌株的洛伐他汀耐受濃度在25 mmol/L以上。通過在洛伐他汀異源合成的酵母菌株中過表達(dá)TapA,分別在搖瓶與5 L反應(yīng)器發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)該蛋白過表達(dá)不僅可以緩解洛伐他汀對(duì)于細(xì)胞的毒性,還可以大幅提升重組菌株的洛伐他汀生產(chǎn)能力。再者,我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外的莫納克林J大約只有2%可以穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),證實(shí)了莫納克林J存在跨膜困難的問題。在異源生產(chǎn)莫納克林J的酵母菌株中利用PAOXl啟動(dòng)子過表達(dá)TapA,以甲醇為碳源,發(fā)現(xiàn)搖瓶中莫納克林J產(chǎn)量提升,而反應(yīng)器中莫納克林J產(chǎn)量下降。通過細(xì)胞內(nèi)外莫納克林J含量檢測(cè),發(fā)現(xiàn)TapA過表達(dá)菌株J#9-TapA的細(xì)胞內(nèi)莫納克林J比例高達(dá)49%,而農(nóng)過表達(dá)TapA菌株J#9的細(xì)胞內(nèi)莫納克林J含量僅為16%。我們推測(cè),反應(yīng)器合成MJ的能力高于搖瓶,細(xì)胞內(nèi)外的莫納克林J濃度差較大,這種勢(shì)能促使TapA蛋白將細(xì)胞外的莫納克林J轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi),以維持較小的細(xì)胞內(nèi)外莫納克林J濃度差,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)莫納克林J對(duì)細(xì)胞的毒性增大,細(xì)胞合成莫納克林J能力減弱。最后,我們?cè)诟弋a(chǎn)莫納克林J的酵母菌群系統(tǒng)中進(jìn)一步探索了TapA提升莫納克林J生產(chǎn)能力的潛力。首先,利用高水平葡萄糖阻遏/低水平葡萄糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PHXTl控制脂肪酸合酶基因的表達(dá)調(diào)控,以乙醇為碳源高效提升產(chǎn)物的合成能力,實(shí)現(xiàn)反應(yīng)器發(fā)酵中莫納克林J產(chǎn)量提高了45%。以此為基礎(chǔ),在菌群系統(tǒng)的下游菌株中過表達(dá)蛋白TapA,發(fā)現(xiàn)不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子表達(dá)TapA時(shí)效果存在明顯差異,與未過表達(dá)TapA蛋白的菌群相比,過表達(dá)TapA蛋白的菌群在搖瓶培養(yǎng)時(shí)莫納克林J產(chǎn)量在9%～140%范圍波動(dòng)。相比之下,表達(dá)TapA蛋白的啟動(dòng)子強(qiáng)度越強(qiáng),菌群的莫納克林J產(chǎn)量越高。反應(yīng)器發(fā)酵時(shí),莫納克林J產(chǎn)量最高為1.4g/L,過表達(dá)TapA后莫納克林J產(chǎn)量不升反降,我們推測(cè),這是因細(xì)胞內(nèi)外莫納克林J濃度差增大,勢(shì)能促使TapA發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)功能導(dǎo)致。此外,我們還研究了TapA與中間產(chǎn)物二氫莫納克林L之間的關(guān)系,由于碳骨架差異較大,TapA對(duì)二氫莫納克林L基本沒有轉(zhuǎn)運(yùn)功能。本研究表明四種他汀泵蛋白在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中對(duì)莫納克林J和洛伐他汀均可以發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)功能,并在一定程度上緩解異源表達(dá)菌株的生長代謝壓力,提升菌株合成他汀類化合物的能力,為合成辛伐他汀等其他藥用價(jià)值更高的化合物提供了新思路。
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TQ464
【圖文】：

ＬＤＫＳ）Ｉ｜４Ｉ。ＬＮＫＳ埅因的表征對(duì)ｒ？理解＝：試兌納克林Ｌ和洛伐他汀的碳骨架組裝具有重逡逑要意義，ＬＮＫＳ邐的產(chǎn)物＞與ＬｏｖＣ邋（假定的烯酰還原酶湘瓦作用，催化生物合成途徑逡逑的第一部分反應(yīng)，產(chǎn)生二氫莫納克林Ｌ（圖１．２）［｜５１。在洛伐他汀合成途徑的最后一步，／ｏｖＦ逡逑表達(dá)的ＬＤＫＳ與催化２－甲基丫酸與莫納克林Ｊ相連接的ｌｏｖＤ邋（醋酶）相互作用［１５１，編碼逡逑這些酶和調(diào)節(jié)因子的基因闡明丫丨：曲霉中洛伐他汀的產(chǎn)生機(jī)制。Ａｕｄａｉｒ等【１６１發(fā)現(xiàn)ＬＮＫＳ逡逑催化六肽的分子內(nèi)Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ封閉，形成雙環(huán)系統(tǒng)，具符與：氫莫納克林Ｌ相同的環(huán)逡逑立體化學(xué)。N希荷锨拙曛醒芯柯宸ニ∩錆銑傻模校耍雍蟛街�，发相嵦ｅP觶玫鞍椎淖麇義嫌檬僑繁＃蹋錚觶碌皍4正確組裝洛伐他汀中的非缺失鏈，而ＬｏｖＦ蛋白連接甲基丁酸酯側(cè)逡逑鏈不需要ＬｏｖＣ蛋〔丨，ＬｏｖＣ蛋白在二氫莫納克林Ｌ的ＰＫＳ后加［：中沒有發(fā)揮可檢測(cè)的逡逑功能［｜７１。Ｘｕ等【１８１鑒定出硫酯酶ＬｏｖＧ負(fù)貴從ＬｏｖＢ中釋放產(chǎn)物，還可以清除ＬｏｖＢ屮的逡逑中間體�？傊宸ニ』虼氐难衃偝浞直礱鞴丶锝槌殺嗦氳模陡雒鋼苯硬五義嫌肫瀋錆銑桑祝祝傘ｅ義希埃遙疲卞澹希遙疲插澹

本文編號(hào)：2798384