【摘要】：枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是一種被美國食品和藥物管理局列為原則上認為安全的微生物(GRAS),并且具有較強的蛋白分泌能力,因此,被廣泛用于外源蛋白的表達。本實驗室前期工作中從自然界篩選得到了一株菌體生長及分泌蛋白性能優(yōu)良的枯草芽孢桿菌,但它存在很多野生性狀,不適合直接作為外源基因表達宿主菌。本研究通過建立枯草芽孢桿菌CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)對該菌株進行一系列改造,并通過啟動子篩選得到一種適用于該菌株的雙啟動子表達載體。本研究所用的模型酶包括用于環(huán)糊精生產(chǎn)的β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(β-CGTase)和α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(α-CGTase)以及用于淀粉脫支的普魯蘭酶,其中重點對普魯蘭酶的制備進行了研究。主要結(jié)果如下:(1)在枯草芽孢桿菌中建立了CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng),并經(jīng)過基因敲除獲得了發(fā)酵性能改善的菌株。以B.subtilis ATCC 6051_a為宿主菌建立CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng),構(gòu)建了敲除質(zhì)粒,包括sg RNA、cas9基因、同源修復(fù)臂、大腸桿菌復(fù)制原點p15A、溫度敏感的復(fù)制原點PE194、氨芐青霉素篩選標(biāo)記基因和四環(huán)素篩選標(biāo)記基因。采用該基因編輯系統(tǒng)逐步敲除B.subtilis ATCC 6051a中的srf C、 spo IIAC、npr E、apr E和amy E基因,依次得到產(chǎn)泡沫量減少的菌株BS1、產(chǎn)芽孢率降低的菌株BS2、胞外蛋白酶活性降低的菌株BS3及BS4和淀粉酶活性降低的菌株BS5。采用上述方法對本實驗室篩選的菌株進行改造,逐步敲除srf C,spo IIAC,amy E,npr E和apr E基因,得到菌株WS5。(2)以β-CGTase為模型酶在菌株WS5中進行啟動子的篩選優(yōu)化。首先通過搖瓶發(fā)酵考察九個單啟動子P_(amy Q/Ba)、P_(srf)、P_(xyl)、P_(gsiB)、P_(xyl/Bm)、P_(Hpa II)、P_(amy Q)、P_(apr E)和(P_npr E)對β-CGTase表達水平的影響,獲得表達量最高的單啟動子P_(amy Q)。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建六個雙啟動子P_(srf)-P_(amy Q)、P_(xyl)-P_(amy Q)、P_(gsi B)-P_(amy Q)、P_(Hpa II)-P_(amy Q)、P_(amy Q)-P_(amy Q)和P_(npr E)-P_(amy Q),搖瓶發(fā)酵篩選出表達量最高的雙啟動子P_(Hpa II)-P_(amy Q)。熒光定量PCR檢測表明雙啟動子P_(Hpa II)P_(amy Q)相比單啟動子P_(amy Q)和P_(amy Q/Ba),啟動強度較強。采用雙啟動子P_(Hpa II)-Pamy Q’表達普魯蘭酶和α-CGTase,搖瓶發(fā)酵48 h時酶活分別為90.69和9.51 U·m L-1。3-L罐發(fā)酵時雙啟動子P_(Hpa II)-Pamy Q介導(dǎo)的普魯蘭酶酶活可達623.17 U·m L-1,SDS-PAGE電泳分析表明此時蛋白酶降解程度較明顯。(3)六種胞外蛋白酶基因的敲除和普魯蘭酶重組菌發(fā)酵條件優(yōu)化。在菌株WS5的基礎(chǔ)上敲除了剩余的六種胞外蛋白酶基因,得到菌株WS11。搖瓶發(fā)酵α-CGTase和β-CGTase在菌株WS5和WS11中酶活無明顯差異,而普魯蘭酶在菌株WS11中的酶活相比菌株WS5中下降了26.2%。3-L罐發(fā)酵時普魯蘭酶在宿主菌WS11中的酶活可達174.47U·m L-1,SDS-PAGE電泳分析表明此時普魯蘭酶受胞外蛋白酶降解程度相比宿主菌WS5時明顯減弱。對以菌株WS11為宿主的普魯蘭酶重組菌WS11PUL進行搖瓶發(fā)酵優(yōu)化和3-L罐發(fā)酵優(yōu)化,最終3-L罐發(fā)酵酶活可達1047.58 U·m L-1,是搖瓶發(fā)酵的9.48倍。(4)研究蛋白酶對普魯蘭酶表達的影響,并通過優(yōu)化3-L罐發(fā)酵補料培養(yǎng)基進一步提高普魯蘭酶表達量。搖瓶發(fā)酵研究九種普魯蘭酶重組菌WS3PUL到WS11PUL中普魯蘭酶的酶活,發(fā)現(xiàn)重組菌WS5PUL的酶活最高。對重組菌WS5PUL、WS9PUL、WS10PUL和WS11PUL進行3-L罐發(fā)酵實驗,發(fā)現(xiàn)重組菌WS9PUL胞外酶活最高,為2449.62 U·m L-1,是重組菌WS5PUL最高酶活(2094.98 U·m L-1)的1.17倍。重組菌WS5PUL、WS9PUL、WS10PUL和WS11PUL 3-L罐發(fā)酵樣品的動力學(xué)參數(shù)和熱穩(wěn)定性表明胞外普魯蘭酶的折疊水平隨蛋白酶敲除個數(shù)的增加而有所下降。最后對重組菌WS9PUL 3-L罐發(fā)酵補料培養(yǎng)基進行優(yōu)化,當(dāng)碳源葡萄糖和氮源玉米漿及酵母浸膏的比例為4/1時,胞外酶活在99 h達到最高5951.84 U·m L-1。(5)研究了伴侶蛋白對普魯蘭酶表達的影響。在宿主菌WS11中hrc A基因的敲除,伴侶蛋白基因prs A和csa A分別連到游離質(zhì)粒p BE-S194上表達,以及伴侶蛋白基因prs A、csa A、dna K和dna J分別連到普魯蘭酶表達質(zhì)粒p HYPULd4上表達對普魯蘭酶的表達都沒有明顯的正效果,而伴侶蛋白基因grp E連到質(zhì)粒p HYPULd4上表達使普魯蘭酶胞外表達量提高了13%。同時在宿主菌WS4和WS5中伴侶蛋白基因grp E連到質(zhì)粒p HYPULd4上共表達使普魯蘭酶表達量提高4.53%和8.19%,而在宿主菌WS9和WS10中沒有正效果。(6)研究了細胞壁D-丙氨酸酯化調(diào)節(jié)基因dlt B和自溶素編碼基因lyt C的敲除對普魯蘭酶表達的影響,并通過信號肽篩選進一步提高普魯蘭酶胞外表達量。宿主菌WS9通過dlt B基因的敲除得到宿主菌WS9D,并使得普魯蘭酶搖瓶發(fā)酵表達量提高了48%。宿主菌WS9中l(wèi)yt C基因的敲除使得普魯蘭酶搖瓶發(fā)酵表達量提高了24%,而宿主菌WS9D中的lyt C基因的敲除對普魯蘭酶搖瓶發(fā)酵表達量沒有明顯影響。采用高通量的方法篩選到兩個適合普魯蘭酶分泌的信號肽,分別為ywt F基因信號肽和phr K基因信號肽。在宿主菌WS9D中采用ywt F基因信號肽時普魯蘭酶3-L罐發(fā)酵酶活可達8037.91 U·m L-1,是目前資料報道的普魯蘭酶最高發(fā)酵水平。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：TQ920.1
【圖文】：

桿菌中不同分泌途徑信號肽[73]。A：Sec 分泌途徑；B：Tat 分泌途徑；泌途徑；D：Com 分泌途徑nal peptides of different pathway in B. subtilis. A: Sec pathway; B: Tat pathwpathway; D: Com pathway的概述（EC 3.2.1.41）是一種被廣泛使用的淀粉脫支酶，它可以水解支鏈淀粉、α-糊精、β-糊精、糖原和相關(guān)多糖中的 α-1，6 糖苷普魯蘭酶單獨作用或與其它淀粉分解酶如糖化酶、α-淀粉酶、基轉(zhuǎn)移酶復(fù)配作用時，可以把淀粉分解成直鏈淀粉或小的還原的應(yīng)用于乙醇燃料、環(huán)糊精、抗性淀粉、麥芽三糖糖漿等產(chǎn)品生型菌中的表達都較低，在 BacillusflavothermusKWF-1[76]和 An活只有 0.171 和 3.86 U·mL-1。隨著 DNA 重組技術(shù)的發(fā)展，物宿主中得到表達，包括大腸桿菌[78]、枯草芽孢桿菌[79]、地衣芽[81]、畢赤酵母等[82]，目前其胞外最高酶活分別為 1567.9、24.5、1L-1。

B. subtilis ATCC 6051a 發(fā)酵時會產(chǎn)生大量的泡沫，需要添加大量的消泡劑來抑制的產(chǎn)生，不利于發(fā)酵過程的控制，且容易染菌。發(fā)酵過程中產(chǎn)生的兩親分子枯草菌進泡沫的產(chǎn)生，而 srfC 基因?qū)τ谡{(diào)節(jié)枯草菌素的產(chǎn)生很重要。如圖 2-3 所示，采用構(gòu)建的 CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)敲除質(zhì)粒 pHYcas9dsrf1 對 srfC 基因進行敲除。轉(zhuǎn)化敲除質(zhì)粒 pHYcas9dsrf1 到 B. subtilis ATCC 6051a，敲除質(zhì)粒在菌體細胞內(nèi)合as9 蛋白和 sgRNA，Cas9 蛋白在 sgRNA 指引下特異性的切割 srfC 基因處靶位點，然同源修復(fù)臂的指引下菌體內(nèi)的同源修復(fù)系統(tǒng)特異性的修復(fù)靶位點，刪除 6 個堿基并一個 XhoI 酶切位點和 5 個隨機堿基，使 srfC 基因發(fā)生移碼突變失活。篩選敲除成變子時，首先在同源修復(fù)臂外圍的序列處設(shè)計驗證引物對轉(zhuǎn)化子進行菌落 PCR，對產(chǎn)物進行 PCR 產(chǎn)物純化，然后進行 XhoI 酶切，敲除成功突變子的 PCR 驗證產(chǎn)物可 XhoI 酶切開，并且 PCR 驗證產(chǎn)物測序正確。隨后對敲除成功突變體中的敲除質(zhì)粒 51 ℃劃線熱消除。XhoI 酶切驗證（圖 2-4）和測序檢驗 srfC 基因敲除成功，敲除菌株命名為 BS1。轉(zhuǎn)化 pHYcas9dsrf1 后有 66 ±14 個轉(zhuǎn)化子，挑取 30 個轉(zhuǎn)化子進證，有 13 ±2 個菌落敲除成功，敲除效率為 43% ±6%，結(jié)果表明 CRISPR/Cas9 基輯系統(tǒng)在枯草芽孢桿菌中是一種高效的基因編輯方法。

除核酸電泳驗證。M：DL2000 MT：突變型firmation of the frameshift mutatio對菌株 B.subtilisATCC605株 B.subtilisATCC6051a 產(chǎn) 490 μL，而菌株 BS1 產(chǎn)生 h 后兩株菌泡沫高度相似， B.subtilisATCC6051a 中 sr產(chǎn)生。菌株 B.subtilisATCCBS1 在發(fā)酵 66 h 菌體干重達發(fā)酵前 66 h 菌株 B. subtilis菌體的生長可能有一些影響較快一些，可能和其發(fā)酵過

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 余小霞;田健;劉曉青;伍寧豐;;枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)及其啟動子研究進展[J];生物技術(shù)通報;2015年02期

2 陳乃用;枯草芽孢桿菌中質(zhì)粒的穩(wěn)定性問題[J];微生物學(xué)通報;1993年04期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 鄒純;重組Bacillus deramificans普魯蘭酶的高效胞外表達及其應(yīng)用[D];江南大學(xué);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 宋皖;長野芽孢桿菌普魯蘭酶基因在枯草芽孢桿菌中的重組表達及條件優(yōu)化[D];江南大學(xué);2016年

2 王兵波;一種普魯蘭酶嵌合體及其在畢赤酵母中的高效表達[D];江南大學(xué);2016年

本文編號：2790441