【摘要】：L-天冬氨酸α-脫羧酶(L-aspartateα-decarboxylase,EC4.1.1.11,ADC)催化L-天冬氨酸脫去α羧基生成β-丙氨酸。β-丙氨酸在食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用,合成方法主要有化學(xué)合成法和生物合成法。相較于化學(xué)合成法,生物合成法具有副產(chǎn)物少,操作簡便,綠色環(huán)保等優(yōu)點。但是用于催化生成β-丙氨酸的ADC酶活普遍偏低,限制了β-丙氨酸的生物法大規(guī)模制備�；诖�,本研究對赤擬谷盜來源ADC進(jìn)行分子改造,提升其催化性能,并利用全細(xì)胞催化法制備β-丙氨酸。主要研究結(jié)果如下:(1)依據(jù)嗜熱蛋白的氨基酸內(nèi)在進(jìn)化趨勢,將位于酶分子表面的Lys和Gly分別突變?yōu)锳rg和Ala,成功提高了該酶的穩(wěn)定性。共構(gòu)建22個突變體。初篩結(jié)果顯示,大多數(shù)突變體酶活及穩(wěn)定性較野生型相差不大,其中,K49R、K221R、G369A突變體顯示出較好的催化性能。酶學(xué)性質(zhì)測定結(jié)果表明,K221R突變體比酶活較野生酶提高20.3%;在50℃處理30 min,K49R、K221R和G369A的殘余酶活較野生酶提高0.7倍、1.2倍和1.0倍。分子動力學(xué)模擬結(jié)果顯示,突變體K221R、G369A的柔性區(qū)域較野生型減少,并且與周圍氨基酸產(chǎn)生相互作用力,推測是其熱穩(wěn)定性增強的原因。(2)構(gòu)建基因工程菌,建立全細(xì)胞催化生產(chǎn)β-丙氨酸工藝。研究比較了一次性加入高濃度底物、多次添加底物分批補料催化工藝,野生型菌株最佳補料次數(shù)是3次,轉(zhuǎn)化生成β-丙氨酸1079.9 mmol·L~(-1),摩爾轉(zhuǎn)化率為90.0%;K221R菌株和G369A菌株最佳補料次數(shù)為4次,轉(zhuǎn)化生成β-丙氨酸分別為1512.2 mmol·L~(-1)和1509.6 mmol·L~(-1),摩爾轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到94.5%和94.4%。(3)對K221R菌株進(jìn)行5 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵實驗。通過對誘導(dǎo)劑種類和濃度進(jìn)行優(yōu)化,確定最佳誘導(dǎo)劑濃度為終濃度0.8 mmol·L~(-1) IPTG。發(fā)酵53 h左右菌體量達(dá)到OD_(600)=130,最高酶活為851.6 U·mL~(-1)。采用高密度發(fā)酵菌株進(jìn)行全細(xì)胞催化,生成β-丙氨酸1820.0 mmol·L~(-1),摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到91.0%。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TQ922.2
【圖文】：

江南大學(xué)碩士學(xué)位論文結(jié)構(gòu)相似，同為四聚體，前者分子量略大，其 C 末端比 E. coli 多 13 個氨基酸[19]。Cglutamicum 來源的 ADC 不需 panM 蛋白（一種可以促進(jìn) ADC 自裂解的乙酰基轉(zhuǎn)移酶同源蛋白）的輔助[20, 21]，可以通過自剪切過程形成有活性的成熟酶，其應(yīng)用性更強。

圖 1-1 E. coliADC 裂解機(jī)理示意圖. 1-1 Cleavage mechanism ofADC from E磷酸吡哆醛（PLP）依賴型酶[11]。ADC）和谷氨酸脫羧酶（GAD）有為半胱氨酸亞磺酸脫羧酶類或谷氨中于其代謝產(chǎn)物在影響昆蟲角質(zhì)明確。-Ala），又名 β-氨基丙酸。分子式色棱形結(jié)晶，熔點為 200℃，暴露2。

圖 3-1 表面 Lys 和 Gly 在 L-天冬氨酸 α-脫羧酶中的位置a: 紅色表示賴氨酸，綠色表示甘氨酸；b: 由圖 a 翻轉(zhuǎn)一定角度得到Fig. 3-1 The distribution of Lys and Gly inADC three-dimensional structureThe distribution of Lysine and Glycine, red is Lysine and green is Glycine ; b: The graph a rotatecertain angle to get the b graph 突變體的初步篩選初步篩選酶活和熱穩(wěn)定性提高的突變體。取野生型和突變型粗酶液于 37℃反檢測酶活，檢測結(jié)果如圖 3-2 所示。在 K→R 系列突變體中，大部分突變體均以上的酶活，其中 K190R、K220R、K221R、K305R、K480R 酶活較野生型有提升；在 G→A 系列突變體中，G282A 酶活僅剩 40%，G369A 酶活有所提高變體與野生型酶活相差不大。

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 孫濤;孫斐;巢駿;謝晶;周冬香;;C_(70)-β-丙氨酸衍生物抗氧化性的研究[J];化學(xué)研究與應(yīng)用;2012年05期

2 孫濤;孫斐;謝晶;周冬香;;C_(60)/C_(70)-β-丙氨酸衍生物抗氧化性的研究[J];化學(xué)試劑;2012年07期

3 熊煥貴;陳肇熙;;家兔延髓孤束核區(qū)微電泳β-丙氨酸抑制呼吸單位放電[J];生理學(xué)報;1987年03期

4 曾向潮,徐石海,施文兵,鄧芹英;N-(3-吲哚甲�；�)-β-丙氨酸甲酯的合成和表征[J];精細(xì)化工;2004年06期

5 鄭劍恒;張秋萍;吳霞紅;褚羽丹;;β-丙氨酸補充對運動能力的影響[J];體育科研;2019年03期

6 黎冬冬;徐興煙;柳翔;曾向潮;唐桂紅;;N-(2-吡咯甲�；�)-β-丙氨酸甲酯的烷基化反應(yīng)[J];化學(xué)試劑;2010年06期

7 李博;宿承t

本文編號：2790230