【摘要】：紅曲古代稱丹曲,在我國有1000多年歷史,它是以大米為原料,接種紅曲霉發(fā)酵而成的紅曲色素,屬于天然可食用色素。紅曲色素的化學(xué)結(jié)構(gòu)由聚酮發(fā)色團和脂肪酸鏈兩部分組成。�；o酶A結(jié)合蛋白(ACBP)作為高度保守蛋白,存在于真核生物和原核生物中,主要參與脂肪酸代謝。本論文主要對紅曲霉CICC41233中2個ACBP(MrACBP)編碼基因開展與紅曲色素合成相關(guān)研究,取得的主要結(jié)果:(1)Mracbp基因克隆:以紅曲霉CICC41233總DNA和cDNA為模板,PCR擴增得到Mracbp基因。經(jīng)測序后分析Mracbp1 DNA序列全長629 bp,RNA序列全長450 bp,有2個內(nèi)含子,編碼149個氨基酸,預(yù)測分子量16 kDa,NCBI核酸Blast比對與Aspergillus vadensis CBS 113365 ACBP-domain-containing protein(BO88DRAFT_483611)(XM_025712234.1)同源性73.97%,蛋白質(zhì)Blast比對與Aspergillus sclerotiicarbonarius CBS 121057(PYI08169.1)ACBP同源性37.21%。Mracbp2 DNA序列全長1525 bp,RNA序列全長1329 bp,有3個內(nèi)含子,編碼442個氨基酸,預(yù)測分子量51 kDa,NCBI核酸Blast比對與Aspergillus nomius NRRL 13137 acyl CoA binding protein(ANOM_009680)(XM_015554936.1)同源性72.59%,蛋白質(zhì)Blast比對與Aspergillus nomius NRRL 13137(XP_015401904.1)ACBP同源性72.11%。(2)重組蛋白與底物脂酰輔酶A結(jié)合能力測定:將不含內(nèi)含子的Mracbp1構(gòu)建于原核表達載體pMAL-c4X,轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli Rosetta DE3菌株,IPTG誘導(dǎo)目的蛋白大量表達,純化后獲得MBP-MrACBP1融合蛋白,微量熱泳動結(jié)合實驗表明與C_(14:0)脂酰輔酶A結(jié)合能力最強。將不含內(nèi)含子的Mracbp2構(gòu)建于原核表達載體pGEX-6p-1,轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21菌株,IPTG誘導(dǎo)表達目的蛋白,純化后獲得GST-MrACBP2融合蛋白,微量熱泳動結(jié)合實驗表明與C_(16:0)脂酰輔酶A結(jié)合能力最強。(3)Mracbp在紅曲霉CICC41233中過表達產(chǎn)紅曲色素分析:構(gòu)建Mracbp1基因表達載體pNeo0380-gpdA-acbp1和Mracbp2基因表達載體pNeo0380-gpdA-acbp2,農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)轉(zhuǎn)化紅曲霉CICC41233,分別獲得工程菌株紅曲霉ACBP5和紅曲霉ACBP-E。相比紅曲霉CICC41233,紅曲霉ACBP5發(fā)酵6 d,紅曲色素產(chǎn)量提高12.70%。發(fā)酵2 d,熒光定量PCR結(jié)果顯示acbp1和紅曲色素合成基因簇中pks、mppr1、fasA、fasB基因表達分別上調(diào)77.39倍、6.41倍、3.21倍、3.42倍、4.41倍。紅曲霉ACBP-E發(fā)酵6 d,紅曲色素產(chǎn)量提高37.73%。發(fā)酵2 d,熒光定量PCR結(jié)果顯示acbp2和紅曲色素合成基因簇中pks、mppr1、fasA和fasB基因表達分別上調(diào)1.74倍、2.7倍、2.51倍、2.20倍、3.11倍。(4)紅曲霉CICC41233中acbp2基因敲除:為提高紅曲霉基因敲除效率,構(gòu)建DNA ligase IV(ligD)基因敲除載體,農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)轉(zhuǎn)化紅曲霉CICC41233,獲得突變體菌株紅曲霉△ligD。在此基礎(chǔ)上,農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)將構(gòu)建的Mracbp2基因敲除載體轉(zhuǎn)化紅曲霉△ligD,挑選50個轉(zhuǎn)化子進行篩選驗證但并未得到成功敲除acbp2基因的紅曲霉突變體菌株。(5)Mr ACP蛋白表達與純化:在�；d體蛋白(ACP)編碼基因終止密碼子前引入His標簽蛋白,連接于原核表達載體pMAL-c4X中,構(gòu)建MBP+His雙標簽蛋白表達系統(tǒng),轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli Rosetta DE3菌株,IPTG誘導(dǎo)目的蛋白大量表達,鎳柱純化后獲得MBP-MrACP-His融合蛋白。本論文探究了ACBP對紅曲色素合成的影響,為提高紅曲色素的產(chǎn)量提供新思路,為構(gòu)建高產(chǎn)紅曲色素的工程菌株提供新方向。
【學(xué)位授予單位】：江西科技師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TQ925.7;Q78
【圖文】：

霉CICC41233 總RNArophoresis of total of R板， PCR反應(yīng)擴增曲霉 Dacbp 基因凝horesis of Mracbp gen

圖 2.2 紅曲霉 Dacbp 基因凝膠電泳圖2.2Agarose gel electrophoresis of Mracbp gene（a. Dacbp1 b. Dac的cDNA作為模板，進行PCR反應(yīng)擴增基因片段，瓊脂糖 所示。

17圖 2.3 紅曲霉Racbp基因凝膠電泳圖Agarose gel electrophoresis of Mracbp gene（a. Racbp1 b.

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本文編號：2790061