【摘要】：苯乳酸是一種高附加值的酚醛酸,廣泛存在于天然蜂蜜及中草藥中。苯乳酸通過改變微生物生長情況和調(diào)控其群體感應(yīng)對多種細菌和真菌具有抑制作用,是一種新型生物防腐劑;作為丹參素的類似物,與其藥物機理相同,是合成抗血小板凝聚和心肌梗塞藥物的關(guān)鍵前體;同時由于其優(yōu)異的理化性質(zhì),可合成為高機械強度和高穩(wěn)定性的新型聚苯乳酸材料。基于苯乳酸突出的性質(zhì),可廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥、食品工業(yè)和新材料等領(lǐng)域。生物合成法制備苯乳酸,其成本低、反應(yīng)條件溫和、可持續(xù)性強。并且針對苯乳酸高效分離的研究十分缺乏。本論文從具有高催化性能菌株篩選出發(fā),探討菌株和固定化細胞催化過程,提出應(yīng)用天然優(yōu)良菌株進行生物轉(zhuǎn)化是苯乳酸工業(yè)化發(fā)展的方向,并利用雙功能基團晶膠介質(zhì),實現(xiàn)一步法從轉(zhuǎn)化液中分離苯乳酸。主要內(nèi)容包括:(1)高催化活性苯乳酸菌株的篩選。本文從泡菜中分離、篩選得到一株具有較高催化活性的布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri GBS3)。探討了菌株在不同底物作用下發(fā)酵和催化合成苯乳酸能力。結(jié)果表明,在發(fā)酵和催化過程中均可以分別利用苯丙氨酸和苯丙酮酸合成苯乳酸,且以苯丙酮酸為底物全細胞催化合成苯乳酸時產(chǎn)量最高,確定采用苯丙酮酸作為轉(zhuǎn)化底物進行后續(xù)的實驗研究。(2)苯乳酸轉(zhuǎn)化過程的新型優(yōu)化方法。進一步研究了 L.buchneri GBS3在不同發(fā)酵條件下的生長特性,得知溶氧量與菌體的催化能力正相關(guān)但不顯著,確定了菌體的靜置培養(yǎng)方式。建立新型優(yōu)化方法——疊影取樣均勻設(shè)計法,并確定了最佳轉(zhuǎn)化條件:緩沖液pH值8.0,菌體濃度270mg/mL,苯丙酮酸濃度為13 mg/mL,葡萄糖濃度20mg/mL,轉(zhuǎn)化時間15h;在優(yōu)化條件下,苯乳酸濃度為10.93 mg/mL,摩爾轉(zhuǎn)化率達83.07%。(3)L.buchneri GBS3的固定化研究。以甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)為基質(zhì)制備pHEMA晶膠微球,用于固定化細胞研究,考察固定化細胞的批次轉(zhuǎn)化和高密度培養(yǎng)情況。在一定范圍內(nèi),顆粒粒徑與微管內(nèi)徑正相關(guān)。pHEMA晶膠微球的孔隙結(jié)構(gòu)十分發(fā)達,內(nèi)部孔隙可達1～50μm,孔隙率達88.1%。將固定化細胞的載體微球置于含有底物的溶液中進行批次轉(zhuǎn)化實驗。結(jié)果表明,pHEMA載體微球中細胞經(jīng)10次利用后仍具有生物活性,且轉(zhuǎn)化能力明顯優(yōu)于游離細胞,細胞與載體之間的結(jié)合力較強,轉(zhuǎn)化效率隨著顆粒粒徑的增加而增大。應(yīng)用pHEMA載體微球進行固定化細胞的高密度培養(yǎng)。結(jié)果表明,隨著顆粒粒徑的增大,生物量也隨之變大,細胞干重最高為15.6 mg/mL,為懸浮培養(yǎng)的6倍。同時使用海藻酸鈉包埋細胞進行對比研究,結(jié)果表明海藻酸鈉載體微球穩(wěn)定性較差且固定化細胞效果低于pHEMA載體微球。(4)雙功能基團晶膠介質(zhì)對苯乳酸的吸附分離。依據(jù)苯乳酸的結(jié)構(gòu)特點,在pHEMA晶膠基質(zhì)接枝具有陰離子交換季胺基和疏水芐基的功能單體,獲得雙模式晶膠介質(zhì),用于分離苯乳酸。該晶膠介質(zhì)的基礎(chǔ)性能良好,以苯乳酸標準液為原料考察層析柱的靜態(tài)吸附性能,在超純水溶液中分離柱具有最大吸附容量為14.64 mg/mL。比較晶膠柱對無細胞轉(zhuǎn)化液和細胞轉(zhuǎn)化液中苯乳酸的分離效果。以0.3 M氯化鈉溶液為洗脫劑,可一步法從細胞料液中收獲高純度苯乳酸,在流速為1～5 cm/min時,苯乳酸純度和回收率分別在97.4%～97.8%和80.2%～90.8%范圍內(nèi),與層析無細胞澄清料液結(jié)果相似。在流速為1cm/min時,無細胞轉(zhuǎn)化液中苯乳酸純度和回收率分別為98.4%和92.3%,且經(jīng)20批次重復(fù)分離實驗,苯乳酸的純度和回收率分別保持在96.7～98.6%和91.4～93.4%之間,晶膠介質(zhì)均表現(xiàn)出良好的分離和重復(fù)使用性能。結(jié)果表明,雙功能基團晶膠介質(zhì)從細胞轉(zhuǎn)化液中直接分離苯乳酸效果良好,對苯乳酸具有高選擇性,可實現(xiàn)一步分離過程。(5)苯乳酸的非吸附穿透行為模擬。采用課題組建立的數(shù)學(xué)模型,研究了晶膠床層結(jié)構(gòu),并探索苯乳酸在晶膠柱內(nèi)的穿透行為。認為超大孔晶膠連續(xù)床是由不同尺寸的毛細管組成的毛細管群,每個毛細管具有各自的直徑、長度、彎曲度及相同的管壁厚度。通過模型擬合得到晶膠柱內(nèi)毛細管總數(shù)目、毛細管的平均孔徑、骨架厚度及彎曲度等更多微觀晶膠結(jié)構(gòu)參數(shù)。在確定了上述參數(shù)后,通過模型擬合得到晶膠柱的滲透率、孔隙率、床層體積和非吸附條件下苯乳酸的穿透曲線。模型擬合值與實驗測定值相近,擬合效果好,說明毛細管模型可以很好地描述晶膠柱的結(jié)構(gòu)和小分子有機酸的非吸附穿透行為。本論文圍繞苯乳酸合成,從菌株篩選、轉(zhuǎn)化過程優(yōu)化和細胞的固定化出發(fā),重點研究乳酸菌的全細胞催化法和晶膠分離,通過雙功能基團晶膠實現(xiàn)苯乳酸的高效分離,得到富集苯乳酸的轉(zhuǎn)化液,并通過模型描述小分子有機酸的穿透行為,顯示良好的應(yīng)用前景。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：TQ921.3
【圖文】：

１．２．２苯乳酸的化學(xué)合成法逡逑苯乳酸的化學(xué)合成法大體可以分為以下幾種：鋅汞齊還原法、苯丙酮酸催化氫化法、逡逑不對稱環(huán)氧化合成及ＳＮ２反應(yīng)％其合成路線如圖１．２所示。逡逑鋅汞齊還原法合成是以苯甲醛為原料與乙酰甘氨酸先形成吖內(nèi)酯，再經(jīng)過酸裂解、逡逑苯丙酮酸生成以及Ｃｌｅｍｍｅｎｓｅｎ還原，共４個步驟面成。李光興等［３６］以Ｒａｎｅｙ－Ｎｉ為催化逡逑劑將苯丙酮酸通過催化氫化反應(yīng)，得到苯乳酸的白色結(jié)晶物，該合成方法得到的苯乳酸逡逑產(chǎn)率很高，收率和轉(zhuǎn)化率均令人滿意。Ｄｒａａｎｅｎ等［３７］在低溫條件下，Ｌ－苯丙氨酸經(jīng)過快速逡逑的分子內(nèi)Ｓｎ２反應(yīng)形成不穩(wěn)定的脂族重氮鹽，得到了邋ｏｔ－內(nèi)酯，在室溫下與溶劑水發(fā)生反逡逑應(yīng)，再經(jīng)過一個緩慢的分子內(nèi)Ｓｎ２反應(yīng)，水解內(nèi)酯得到最終產(chǎn)物Ｌ－苯乳酸。由于苯乳酸逡逑是一類具有光學(xué)活性的手性物質(zhì)，故其含有兩種對映異構(gòu)體。Ｈａｒａｄａｉ３ｘ］通過Ｄａｒｚｅｎ反應(yīng)逡逑將獲得的反式－Ｐ－苯基縮水甘油酸酯拆分

—ＣＯＯＨ逡逑（ｂ）逡逑圖１．］苯乳酸抑制李斯特菌的抑菌機理：Ｕ）破壞細胞膜和細胞壁（ｂ）阻礙ＤＮＡ功能逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｔｈｅ邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍ邋ｏｆ邋ｐｈｅｎｙｌｌａｃｔｉｃ邋ａｃｉｄ邋ａｉｍ邋ｆｏｒ邋Ｌｉｓｔｅｒｉａ邋ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ：邋（ａ）邋ｄａｍａｇｅ邋ｔｈｅ邋ｃｅｌｌ逡逑ｍｅｍｂｒａｎｅ邋ａｎｄ邋ｃｅｌｌ邋ｗａｌｌ；邋（ｂ）邋ｉｍｐｅｄｅ邋ＤＮＡ邋ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ逡逑１．２．２苯乳酸的化學(xué)合成法逡逑苯乳酸的化學(xué)合成法大體可以分為以下幾種：鋅汞齊還原法、苯丙酮酸催化氫化法、逡逑不對稱環(huán)氧化合成及ＳＮ２反應(yīng)％其合成路線如圖１．２所示。逡逑鋅汞齊還原法合成是以苯甲醛為原料與乙酰甘氨酸先形成吖內(nèi)酯，再經(jīng)過酸裂解、逡逑苯丙酮酸生成以及Ｃｌｅｍｍｅｎｓｅｎ還原，共４個步驟面成。李光興等［３６］以Ｒａｎｅｙ－Ｎｉ為催化逡逑劑將苯丙酮酸通過催化氫化反應(yīng)，得到苯乳酸的白色結(jié)晶物，該合成方法得到的苯乳酸逡逑產(chǎn)率很高，收率和轉(zhuǎn)化率均令人滿意。Ｄｒａａｎｅｎ等［３７］在低溫條件下，Ｌ－苯丙氨酸經(jīng)過快速逡逑的分子內(nèi)Ｓｎ２反應(yīng)形成不穩(wěn)定的脂族重氮鹽，得到了邋ｏｔ－內(nèi)酯，在室溫下與溶劑水發(fā)生反逡逑應(yīng)，再經(jīng)過一個緩慢的分子內(nèi)Ｓｎ２反應(yīng)，水解內(nèi)酯得到最終產(chǎn)物Ｌ－苯乳酸。由于苯乳酸逡逑是一類具有光學(xué)活性的手性物質(zhì)，故其含有兩種對映異構(gòu)體。Ｈａｒａｄａｉ３ｘ］通過Ｄａｒｚｅｎ反應(yīng)逡逑將獲得的反式－Ｐ－苯基縮水甘油酸酯拆分

基因工程和蛋白質(zhì)工程的發(fā)展使得酶學(xué)在生物技術(shù)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。與化學(xué)催逡逑化相比，生物酶催化具有催化效率高、專一性強及酶活性可調(diào)控等特點。苯乳酸的生物逡逑合成途徑如圖１．３所示，苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨為苯丙酮酸，苯丙酮酸進一步還原成苯乳酸。故應(yīng)逡逑用關(guān)鍵酶過表達于工程菌株中或直接進行催化反應(yīng)是一條可行的路線。逡逑（１）酶法轉(zhuǎn)化苯丙氨酸合成苯乳酸逡逑苯乳酸合成開始于苯丙氨酸的分解代謝，苯丙氨酸首先在具有廣譜催化活性的芳香逡逑氨基轉(zhuǎn)移酶作用下將氨基基團轉(zhuǎn)移至合適的ａ－酮酸受體。ａ－酮酸受體在谷氨酸脫氫酶作用逡逑下生成谷氨酸鹽，并且谷氨酸脫氫酶的活性受到細胞氧化還原狀態(tài)的影響，所以可以通逡逑過添加檸檬酸鹽、果糖和葡萄糖等充當可供選擇的電子受體，以此增加ＮＡＤ（Ｐ）＋促進苯逡逑乳酸的合成［５１］．ＤａｌＩａｇｎｏｌ等Ｗ通過在復(fù)合培養(yǎng)基中添加生物合成前體苯丙氨酸和酪氨酸、逡逑中間產(chǎn)物谷氨酸鹽和（Ｘ－酮戊二酸以及電子受體檸檬酸鹽來評價植物乳桿菌ＣＲＬ７７８產(chǎn)抑逡逑菌物質(zhì)的能力，研究表明苯丙氨酸會促進苯乳酸的合成，由于氧化型ＮＡＤ＋含量的增加，逡逑７逡逑

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前9條

1 朱銀龍;

本文編號：2789884