【摘要】：苯乳酸(Phenyllactic acid,PLA)是一種安全無毒且天然的新型廣譜抗菌物質(zhì),可以被應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品和農(nóng)作物等行業(yè)。本文以重組大腸桿菌BL21(DE3)-pRSF-aad-ldh_(10)-fdh為研究對象,旨在降低發(fā)酵培養(yǎng)基的成本和提高3 L發(fā)酵罐水平上苯乳酸合成產(chǎn)量。在搖瓶水平上優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源氮源濃度和種類,結(jié)合菌體密度和發(fā)酵成本選擇最佳單因素;在3 L發(fā)酵罐水平優(yōu)化菌體培養(yǎng)條件,考察攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量對培養(yǎng)體系溶氧值(DO)及菌體密度的影響,為分批補料培養(yǎng)奠定基礎(chǔ);在3 L發(fā)酵罐水平優(yōu)化菌體共表達酶的誘導(dǎo)條件,通過考察全細胞轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸合成苯乳酸的能力,確定了誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時機和誘導(dǎo)溫度。在全細胞轉(zhuǎn)化過程中,添加適量葡萄糖能顯著提高轉(zhuǎn)化效率,本文還探討了葡萄糖在提高苯乳酸轉(zhuǎn)化效率的機理。具體研究結(jié)果如下:(1)搖瓶水平上最適發(fā)酵培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件為:葡萄糖4 g/L、FM802安琪酵母浸粉24 g/L、KH_2PO_4 2.3 g/L、K_2HPO_4 12.5 g/L,初始pH 7.0,250 mL搖瓶裝液量為25 mL,接種量4%,在37°C下,220 r/min培養(yǎng)14 h。(2)在3 L發(fā)酵罐上,采用上述培養(yǎng)基,優(yōu)化了發(fā)酵條件(攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量)和補料分批策略(恒速流加、pH-stat和DO-stat)。在攪拌轉(zhuǎn)速為400 r/min,通空氣量為1.5 vvm,采用恒速補料策略,發(fā)酵培養(yǎng)3 h開始將400 g/L葡萄糖以10 mL/h恒速補料10 h,在此條件下細胞干重達到13.71 g/L。(3)在3 L發(fā)酵罐上對誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時機和誘導(dǎo)溫度進行優(yōu)化,確定最佳誘導(dǎo)劑濃度為0.08 mmol/L,誘導(dǎo)時機為培養(yǎng)2 h之后,誘導(dǎo)溫度為25℃。(4)在3 L發(fā)酵罐上優(yōu)化全細胞轉(zhuǎn)化條件:NADH再生、底物濃度、轉(zhuǎn)化溫度、pH、攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量,結(jié)果表明,以葡萄糖作為輔酶NADH再生來源,當細胞干重為30 g/L、轉(zhuǎn)化溫度為37℃、pH 7.0、300 r/min和通空氣量1.0 vvm時,在3 L發(fā)酵罐中生物轉(zhuǎn)化30 g/L底物L(fēng)-苯丙氨酸合成苯乳酸,產(chǎn)量為25.4 g/L,轉(zhuǎn)化率達84.7%。(5)從胞內(nèi)ATP水平的變化、細胞干重的變化、從葡萄糖合成苯乳酸的情況以及細胞膜完整性分析葡萄糖在提高苯乳酸轉(zhuǎn)化效率的機理,研究結(jié)果表明,在全細胞轉(zhuǎn)化過程中添加葡萄糖可有助于提高細胞中ATP的水平,緩解苯乳酸導(dǎo)致的細胞活力下降及ATP減少,維持細胞在轉(zhuǎn)化過程中的活性;在全細胞轉(zhuǎn)化過程前后,添加葡萄糖對細胞干重和細胞膜的影響不明顯;重組大腸桿菌BL21(DE3)-pRSF-aad-ldh_(10)-fdh可以利用葡萄糖直接合成苯乳酸,轉(zhuǎn)化率最高為0.433%。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TQ921
【圖文】：

(DE3)-pRSF-aad-ldh10-fdh為研究對象（圖1-2），在搖瓶優(yōu)化的基礎(chǔ)上，研究了3 L發(fā)酵罐水平大腸桿菌BL21(DE3)-pRSF-aad-ldh10-fdh的培養(yǎng)條件，共表達酶的誘導(dǎo)條件、全細胞轉(zhuǎn)化苯丙氨酸合成苯乳酸的條件以及探究了外源添加葡萄糖在全細胞催化過程中的作用。圖 1-2 大腸桿菌 BL21(DE3)-pRSF-aad-ldh10-fdh 中苯乳酸生物合成途徑Fig. 1-2 The phenyllactic acid biosynthetic pathway engineered into E.coli BL21(DE3) harboringpRSF-aad-ldh10-fdh本文主要從以下幾個方面進行研究：（1） 在搖瓶水平上，針對發(fā)酵培養(yǎng)基碳源氮源種類和濃度進行優(yōu)化，在獲得較多菌體前提下，與原始的 TB 培養(yǎng)基相比，需要減低發(fā)酵培養(yǎng)基的成本，為 3 L 發(fā)酵罐水平培養(yǎng)菌體奠定基礎(chǔ)。（2） 在 3 L 發(fā)酵罐水平上，研究了攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量和分批補料策略對重組大腸桿菌生長的影響，按時間取樣測定體系中殘?zhí)菨舛群途w密度并且通過在線軟件監(jiān)測pH 和溶氧的變化。（3） 在 3 L 發(fā)酵罐水平上

圖 3-16 苯乳酸從頭（葡萄糖）合成途徑Fig. 3-16 De novo synthesis pathway of PLA from glucose將細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)后，離心收集，用不同濃度葡萄糖溶液（5 g/L、10 g/L、15 g/L0 g/L）重懸，37oC 培養(yǎng) 20 h。如圖 3-17 所示，與標準品的色譜質(zhì)譜圖對比，發(fā)酵液 與 標 準 品 具 有 相 同 的 液 相 出 峰 時 間 和 m/z ， 說 明 大 腸 桿 L21(DE3)-pRSF-aad-ldh10-fdh 可以將葡萄糖（不添加底物苯丙氨酸）轉(zhuǎn)化為苯乳酸據(jù)標準品與樣品的峰面積，計算出不同實驗組別中苯乳酸的含量。STANDARD 0.05mg/mlTime2.00 4.00 6.00 8.00 10.00%020180626-7 1: TOF MSMS ES-TIC3.41e3AreaArea%100.00Area314.26Height3394Time4.294.29314STANDARD 0.05mg/mlm/z20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220%010020180626-7 582 (4.287) 1: TOF MSMS 165.00ES-165.1402147.173.0119.1103.1148.1166.1120180626-3 1: TOF MSMS ES-TIC1.90e3Area4.29168110020180626-3 586 (4.316) 1: TOF MSMS 165.00ES-165.1130

其中一組同時加入 1%葡萄糖（圖3-19b），電鏡結(jié)果顯示，用 20 g/L 苯乳酸處理大腸桿菌 BL21(DE3)-pRSF-aad-ldh10-fdh，細胞結(jié)構(gòu)變化不大，細胞膜損傷不明顯；當同時用苯乳酸和 1％葡萄糖處理細胞時，細胞膜的表觀形態(tài)與僅僅用苯乳酸處理的結(jié)果幾乎一致，說明 20 g/L 苯乳酸對大腸桿菌BL21(DE3)-pRSF-aad-ldh10-fdh 細胞膜完整性影響可以忽略，葡萄糖的加入也未引起任何細胞形態(tài)變化。圖 3-19 大腸桿菌 BL21(DE3)-pRSF-aad-ldh10-fdh 電鏡圖（a）僅采用 20 g/L 苯乳酸處理 8 h；（b） 用 20 g/L 苯乳酸和 1%葡萄糖處理 8 hFig. 3-19 Cold FESEM images of E. coli BL21(DE3) harboring pRSF-aad-ldh10-fdh.(a) Cells were treated with 20 g/L PLA for 8 h; (b) Cells were treated with 20 g/L PLA and 1% glucose for8 h江南大學(xué)碩士學(xué)位論文

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本文編號：2789778