【摘要】：幾丁質(zhì)脫乙酰基酶(EC 3.5.1.41,CDA)是參與幾丁質(zhì)修飾的關(guān)鍵酶,能將幾丁質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單元N-乙酰-D-葡萄糖胺的乙�；鶊F(tuán)脫去,形成殼聚糖并釋放乙酸。CDA分布于昆蟲的表皮、氣管、中腸圍食膜等多個(gè)富含幾丁質(zhì)的器官,干擾CDA的表達(dá)會(huì)造成昆蟲發(fā)育異常以致死亡。因此CDA是潛在的害蟲防治靶標(biāo),對(duì)CDA的抑制劑研究可應(yīng)用于開發(fā)綠色生物農(nóng)藥。然而,目前僅有真菌和細(xì)菌CDA的抑制劑研究,尚無昆蟲CDA抑制劑的報(bào)道。昆蟲CDA蛋白結(jié)構(gòu)與真菌和細(xì)菌CDA蛋白結(jié)構(gòu)相似性較差,因此以往的研究對(duì)昆蟲CDA抑制劑的開發(fā)借鑒意義有限。本論文以鱗翅目害蟲靶標(biāo)基因研究的模式昆蟲家蠶的BmCDA7為研究對(duì)象,開展以抑制劑開發(fā)為目的的如下研究:(1)對(duì)重組BmCDA7進(jìn)行畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá),采用金屬螯合層析法及離子交換層析法對(duì)其進(jìn)行精細(xì)分離純化,獲得高純度重組BmCDA7蛋白;(2)通過凝膠法結(jié)合熒光增白劑染色的方法,定性檢測(cè)了重組BmCDA7的催化活性�；钚匀旧Y(jié)果顯示,重組BmCDA7蛋白在紫外燈下呈現(xiàn)藍(lán)白色熒光條帶,表明重組BmCDA7能夠催化乙二醇幾丁質(zhì)底物發(fā)生脫乙酰基反應(yīng);(3)基于檢測(cè)催化反應(yīng)釋放乙酸量的活性測(cè)定方法,首先確定重組BmCDA7催化反應(yīng)最適條件以及檢測(cè)了其對(duì)不同幾丁質(zhì)底物的催化活性。結(jié)果表明,以乙二醇幾丁質(zhì)為底物時(shí),重組BmCDA7的適宜反應(yīng)溫度是50°C 65°C,適宜反應(yīng)pH為7.0 11.0。此外,該酶在低于60°C和堿性環(huán)境下具有較高的穩(wěn)定性,對(duì)酸性環(huán)境較為敏感,在低pH條件下其酶活性較低且極易失活。在最適反應(yīng)條件下,重組BmCDA7對(duì)乙二醇幾丁質(zhì)、膠體幾丁質(zhì)底物均具有催化活性,分別為2.9926和0.4270μmol/min/μmol;(4)測(cè)定了23種小分子化合物對(duì)重組BmCDA7酶活性的影響,篩選出ZINC33253064和ZINC33253026兩種化合物對(duì)BmCDA7酶活性具有抑制作用,測(cè)得的抑制率分別達(dá)到(31.01±2.17)%和(25.53±1.62)%。綜上,通過對(duì)重組BmCDA7蛋白的精細(xì)分離純化和生化性質(zhì)、抑制劑的研究,不僅加深了對(duì)家蠶幾丁質(zhì)脫乙酰基酶催化性質(zhì)的認(rèn)識(shí),同時(shí)為開發(fā)特異性的生物農(nóng)藥用于害蟲防治具有指導(dǎo)意義。
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TQ450.1

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