發(fā)布時間：2020-08-10 19:41

【摘要】：盡管抗生素在治療傳染病方面取得了巨大的成功,然而細菌感染仍然是全球最主要的健康問題之一。常規(guī)抗生素治療細菌感染面臨靶向分布差、生物利用率低、日益增長的耐藥性、生物被膜內滲透性低、胞內細菌清除效果差、系統(tǒng)毒性等問題。近年來,納米遞送體系的迅速發(fā)展提供了細菌感染治療的新策略。納米遞送體系可增強藥物循環(huán)穩(wěn)定性,靶向感染組織或細胞,并控制定點釋放藥物速率,從而增加感染部位生物活性藥物的濃度,減少給藥劑量和頻率,改善治療效果,減少藥物副作用。本論文針對細菌靶向性、細菌被膜、胞內菌、耐藥菌和非抗生素治療等方面存在的關鍵問題,設計具有多重刺激響應性的載藥納米粒子,開展載體聚合物結構設計、刺激響應機制和治療效果的研究。針對細菌治療靶向性的要求,構建了以萬古霉素為靶向基團的載藥納米膠束。通過開環(huán)聚合反應合成了能被脂肪酶降解的兩親性共聚物聚乙二醇-聚己內酯(PEG-PCL,簡稱PECL_(2k)),并通過腙鍵接枝萬古霉素(VAN)作為靶向細菌的基團,封裝疏水性抗菌劑環(huán)丙沙星(CIP)形成載藥納米膠束Van-hyd-PECL_(2k)/Cip,其粒徑約為76.9 nm,載藥量約為4.5%。該納米膠束能夠靶向識別細菌,在酸和脂肪酶的作用下釋放CIP,殺滅細菌。相對于自由藥物,Van-hyd-PECL_(2k)/Cip納米膠束通過增強滲透與滯留(EPR)效應和主動靶向在細菌感染部位富集,減少藥物用量,利用感染部位的生化因子(H~+和脂肪酶)的刺激釋放CIP,殺滅組織內的細菌,延長小鼠的壽命。基于生物被膜對抗生素滲透性和敏感性降低從而產生耐藥性的現(xiàn)狀,構建了酸和酶敏感的載藥納米膠束。通過N,N-二異丙基乙二胺(DIP)氨解聚乙二醇-聚天冬氨酸芐酯(PEG-PBLA)合成了具有酸敏感的兩親性聚合物PEG-PAsp(DIP)。將丁二酸酐羧基化的阿奇霉素(Az-sa)接枝到聚合物十八氨-聚天冬氨酸-二乙烯三胺(OA-PAsp(DET))的側鏈得到具有脂肪酶響應的聚合物前藥OA-PAsp(DET/DET-sa-Az)。聚合物與聚合物前藥混合物自組裝形成雜合納米膠束DOEAz,之后通過靜電吸附順式烏頭酸酐修飾的右旋酪氨酸(CA-Tyr),形成同時載有生物被膜分散劑右旋酪氨酸(D-Tyr)和抗菌劑阿奇霉素(Az)的雜合納米膠束DOEAz@Tyr,其粒徑為107 nm,Az的載藥量約為19.1%,CA-Tyr的載藥量約為1%。該納米膠束能在生物被膜內酸性pH刺激下通過DIP質子化改變PEG-PAsp(DIP)親疏水性,使納米膠束粒徑減小。與此同時斷裂烏頭酸酰胺鍵釋放生物被膜分散因子D-Tyr引發(fā)納米膠束電荷反裝帶正電,之后在脂肪酶的刺激下釋放抗生素,使納米膠束解體。相對于自由藥物,DOEAz@Tyr雜合納米膠束通過EPR效應在生物被膜感染部位聚集,并通過生物被膜表面孔道進入其內。在生物被膜內酸性刺激下納米膠束粒徑減小并且表面電荷發(fā)生變化,釋放的D-Tyr破壞生物被膜的完整性,使小粒徑帶正電的納米膠束擴散到生物被膜內層。在脂肪酶的作用下釋放Az殺滅被膜內細菌,最終通過雙重機制清除植入器械表面已形成的生物被膜,達到治療體內生物被膜感染的目的。根據(jù)細菌分泌滅活酶從而產生耐藥性的機理,構建了pH/活性氧(ROS)敏感的雙藥載體納米膠束。將氨芐青霉素(Amp)通過ROS敏感基團(TK)與β-內酰胺酶(Bla)抑制劑苯硼酸(PBA)修飾的四苯乙烯(TPE)偶聯(lián),然后通過酸敏感的硼酸酯鍵偶聯(lián)到β-環(huán)糊精(β-CD)上合成具有pH/ROS敏感的前藥分子β-CD-PBA-TPE-TK-Amp(縮寫為CPTTA)。通過金剛烷(Ad)修飾聚乙二醇-聚己內酯(PEG-PCL)的疏水端合成共聚物PEG-PCL-Ad(縮寫為PECLA)。PECLA與CPTTA通過主客體反應絡合后在水溶液中自組裝形成pH/ROS雙敏感的納米膠束,其粒徑約為113.6 nm,Amp的載藥量約為8.3%。該納米膠束具有多重敏感性,在生化因子(H~+和脂肪酶)的刺激下釋放Bla抑制劑和抗生素的二聚體PBA-TK-Amp;在白熾燈光照下TPE能產生ROS使TK鍵斷裂,釋放抗生素Amp。與自由藥物相比,PECLA@CPTTA納米膠束能將Bla抑制劑和抗生素同時運輸?shù)礁腥静课?通過EPR效應在感染部位富集;在感染部位的酸和脂肪酶的刺激下釋放二聚體PBA-TK-Amp,能抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)分泌的Bla活性,避免β-內酰胺抗生素Amp水解,恢復MRSA對Amp的敏感性;之后在外界物理因子光的刺激下,TPE產生ROS使TK鍵斷裂,釋放抗菌素Amp殺滅游離或附著狀態(tài)的MRSA,從而達到治療耐藥菌皮下感染的目的。針對抗生素在感染細胞內滲透性低、滯留效果差等問題,構建了主動靶向細胞的雙酶敏感載藥納米顆粒。利用4-氨基丁酸作為引發(fā)劑,丙烯酸修飾的磷酸三乙酯(EPE-Ar)和丙烯酸修飾的四苯乙烯(TPE-Ar)作為單體,通過邁克加成反應合成了隨機共聚物P(EPE-co-TPE),將甘露糖(Man)通過PEG接枝到共聚物側鏈,獲得能夠靶向巨噬細胞的雙酶敏感的共聚物Man-g-P(EPE-co-TPE)。通過邁克加成反應將去鐵胺(DFO)接枝到丙烯酸修飾的環(huán)丙沙星(Cip-Ar)上合成嗜鐵素環(huán)丙沙星(DFO-Cip,縮寫為DC)。在水相中共聚物Man-g-P(EPE-co-TPE)能自主裝形成發(fā)射藍色熒光的納米顆粒MPET,通過物理包裹DC與三價鐵離子(Fe~(3+))的螯合物D_(Fe)C,形成熒光淬滅的載藥納米顆粒MPET@D_(Fe)C,其粒徑約為135 nm,載藥量約為11%。該納米顆粒能夠主動靶向巨噬細胞,促進抗生素在感染細胞內積累。在感染細胞內細菌大量分泌脂肪酶和磷脂酶的作用下,MPET@D_(Fe)C納米顆粒會快速降解,釋放嗜鐵素抗菌劑D_(Fe)C殺滅胞內細菌,并通過降解產物TPE的聚集誘導發(fā)光效應監(jiān)控這一過程。相對于自由藥物,MPET@D_(Fe)C納米顆粒能有效地清除胞內菌,有效地延長小鼠的壽命。基于常規(guī)抗生素的毒性和耐藥限制,構建了不同于小分子抗生素殺菌方式的光熱/一氧化氮(NO)聯(lián)合治療的納米抗菌藥物。通過異戊酸修飾聚乙二醇-聚賴氨酸(mPEG-b-PLL)的側鏈合成了雙親陽離子聚合物mPEG-b-P(LL-co-LLIR)(縮寫為PELI),并通過抑菌實驗和溶血實驗篩選出接枝率為50%的PELI作為抗菌聚合物。通過巰基乙胺與亞硝酸特丁酯反應合成具有熱敏的亞硝基硫醇類NO供體(CysamNO)。利用黑磷量子點(BPQDs)靜電吸附CysamNO形成BPQD-SNO,再與PELI靜電相互作用制備載有NO供體和光熱劑BPQDs的納米顆粒PELI@BPQD-SNO,其粒徑約為125.7 nm,BPQDs的攜載量約為10%,NO供體的吸附量為0.034μmol/mg。該納米顆粒提高BPQDs的穩(wěn)定性,在近紅外光(NIR)照射下10分鐘會產生大量的熱,同時溫度的升高促進熱敏感鍵S-NO斷裂釋放NO。PELI@BPQD-SNO具有廣譜抗菌性,在熱和NO協(xié)同作用下能破壞革蘭氏陰性菌和陽性菌的細胞膜。相對于小粒徑的BPQDs,PELI@BPQD-SNO納米顆粒能通過EPR效應細菌感染部位富集,在NIR光照射下升高感染部位溫度并釋放NO,聯(lián)合殺滅膿腫感染部位的細菌,促進傷口的愈合。
【學位授予單位】：西南交通大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R515;TB383.1;R943
【圖文】：

根據(jù)抗菌機制（如圖1-1 所示）可以將抗生素以分為以下幾類：（1）干擾細胞壁合成的抗生素，如能抑制粘肽合成、造成細胞壁缺損的 β-內酰胺類、能抑制肽聚糖合成的糖肽類抗生素；（2）抑制蛋白質合成的抗生素，如大環(huán)內酯類、氨基糖苷類、四環(huán)素類和惡唑烷酮類；（3）干擾核酸合成的抗生素，如氟喹諾酮類和利福霉素類；（4）破壞細菌膜結構的抗生素，如多粘菌素能與帶負電的細胞膜發(fā)生靜電相互作用，導致膜上的 Ca2+、 Mg2+失衡，破壞細胞膜結構，使細菌溶解死亡[6]；（5）抑制代謝途徑的抗生素，如磺胺類和葉酸類似物等。圖 1-1 抗生素作用的主要細菌靶點[7]：（A）抑制蛋白合成；（B）破壞細胞壁結構；（C）干擾葉酸代謝；（D）干擾 DNA 或 RNA 的復制。1.1.2 抗生素治療存在的問題盡管抗生素的治療功效已被充分認可，但目前的抗生素藥物治療存在許多局限性，如生物利用率低、對細菌感染部位滲透性差、不良副作用等。通過傳統(tǒng)的口服或靜脈注射給?

當作敵人趕出去，來減少細胞內的藥物積；如革蘭氏陽性菌和陰性菌產生了諾酮類抗生素的外排泵[17]。（2）產生滅活酶，即細菌會產生一種或多種水解酶來水解或修飾抗菌素藥物，使其到達靶位前完全失活；如 Bla 會特異性的 β-內酰胺環(huán)發(fā)生水解，使其失去抗菌效果[18]；氨基糖苷類鈍化酶會導致抗菌子結構發(fā)生改變（羥基磷酸化、氨基乙酰化或羥基核苷化），失去抗菌活性[19]�？股刈饔冒悬c，即細菌可以通過修飾或消除結合位點來改變抗生素的靶位霉素結合蛋白 2B 的改變，導致青霉素耐藥[14]。（4）改變細胞壁通透性，即細調或改變抗生素進入細胞所需的外膜通道。隨著耐藥菌的出現(xiàn)，迫切需要開菌藥物。然而，自 1980 年開始，每年新上市的抗生素種類正在逐年遞減，原新的抗生素開發(fā)難度越來越大；另一方面，一般一種新的抗生素在上市后，兩年時間就會出現(xiàn)新的耐藥菌，且會刺激細菌變得更加頑強，使得治療更加困，探索開發(fā)治療細菌耐藥感染的新策略，是目前亟需解決的重要問題。

圖 1-3 （A）生物被膜的形成過程[30]；（B）生物被膜的耐藥機制[14]。.1.5 胞內細菌感染先天免疫系統(tǒng)中的吞噬細胞（如單核細胞、中性粒細胞、巨噬細胞）在預防細染和保護身體方面起著至關重要的作用[31]。當細菌入侵機體后，吞噬細胞會識別，吞噬后形成吞噬體，進一步與溶酶體融合形成吞噬溶酶體，然后通過多種機制滅細菌。其中包括刺激誘導吞噬細胞產生一氧化氮（NO）、活性氧（ROS）、抗菌AMPs）等抗菌因子[32]；抑制細菌對鐵離子、氨基酸、脂肪酸等重要營養(yǎng)物質的攝取發(fā)吞噬細胞自噬和胞葬來清除細菌[33]。然而，一些病原菌已經進化出了干擾巨噬

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本文編號：2788519