【摘要】：小麥?zhǔn)鞘澜缛蠹Z食作物之一,小麥赤霉病是世界性的重要病害,不僅造成糧食作物的減產(chǎn),還會(huì)產(chǎn)生大量真菌毒素威脅人畜安全,因此,防控小麥赤霉病具有重要意義。小麥赤霉病的病原菌主要為禾谷鐮刀菌,其產(chǎn)生的DON毒素受很多因素的調(diào)控。Rab7蛋白作為調(diào)控蛋白,可通過與上游調(diào)節(jié)子和下游效應(yīng)子結(jié)合協(xié)同發(fā)揮調(diào)控功能。RILP(Rab互作溶酶體蛋白)是Rab7的效應(yīng)因子之一。禾谷鐮刀菌中FgRab7影響DON毒素的生物合成,但FgRILP對(duì)DON毒素的影響未知。本研究對(duì)禾谷鐮刀菌FgRILP的功能進(jìn)行初探。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),FgRILP含有鹽耐受負(fù)調(diào)控因子NST1蛋白、TolA蛋白、微管結(jié)合蛋白(MIP-T3)和Atrophin-1蛋白多個(gè)保守域;系統(tǒng)發(fā)育分析顯示,禾谷鐮刀菌PH-1的FgRILP與另一株禾谷鐮刀菌的假定蛋白、黃色鐮孢菌的脅迫反應(yīng)蛋白在同一個(gè)分支,推測該基因與鹽脅迫有關(guān)。運(yùn)用同源重組技術(shù)構(gòu)建了FgRILP基因敲除和過表達(dá)突變體,對(duì)突變體進(jìn)行了鹽脅迫和非脅迫下的表型分析。結(jié)果顯示,在非鹽脅迫條件下,突變體菌株與野生型的菌落形態(tài)無差異,但過表達(dá)突變體的菌絲生長更快,FgRILP敲除突變體菌絲生長減慢(p0.05);與野生型相比,FgRILP敲除突變體產(chǎn)孢量略有降低,FgRILP過表達(dá)突變體產(chǎn)孢量略有升高,FgRILP突變體和野生型的孢子萌發(fā)速率一致;FgRILP突變體和野生型均具侵染性,但FgRILP敲除突變體侵染力小于野生型和FgRILP過表達(dá)突變體,表明FgRILP基因與禾谷鐮刀菌的生長發(fā)育、產(chǎn)孢量、致病性相關(guān),對(duì)孢子的萌發(fā)和形態(tài)無影響。與非脅迫相比,在1.0M NaCl、0.08M LiCl及剛果紅脅迫后,菌絲形態(tài)更稀疏,生長速度明顯減慢(p0.01);鹽脅迫下突變體與野生型菌株產(chǎn)生的分生孢子明顯變形,產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)速率均顯著降低,FgRILP突變體的產(chǎn)孢量均低于野生型;NaCl脅迫下,FgRILP敲除突變體的菌絲生長速率比野生型生更慢(p0.05),FgRILP敲除突變體致病力弱于野生型。暗示FgRILP基因在鹽脅迫下對(duì)菌株生長、致病性等方面的調(diào)控作用。本研究進(jìn)一步分析了FgRILP對(duì)DON毒素合成的影響。在小麥基質(zhì)培養(yǎng)基中,非脅迫和NaCl脅迫下,FgRILP敲除突變體的DON合成量均顯著低于野生型(p0.05);在0.08M LiCl脅下,FgRILP敲除突變體的DON合成量比野生型相稍高。在產(chǎn)毒液體培養(yǎng)基中,NaCl脅迫下,FgRILP敲除突變體的DON合成量顯著低于野生型(p0.05);在0.08M LiCl脅迫下,FgRILP敲除突變體DON毒素的合成量略高于野生型。并且經(jīng)過Tri5基因的表達(dá)量分析,發(fā)現(xiàn)在受NaCl脅迫下,其相對(duì)表達(dá)量與毒素測定結(jié)果相一致。表明FgRILP影響了禾谷鐮刀菌DON毒素的合成,在鹽脅迫下具有調(diào)控作用。本研究還利用酵母雙雜交分析了FgRILP與FgRab7的相互作用情況,結(jié)果表明,FgRILP與FgRab7沒有相互作用。但通過實(shí)時(shí)定量PCR分析兩個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn),FgRILP在FgRab7敲除突變體中的相對(duì)表達(dá)量下調(diào),FgRab7在FgRILP敲除突變體的表達(dá)量上調(diào),可能FgRab7為了發(fā)揮調(diào)控作用,表達(dá)量上調(diào),表明二者存在一定的相互關(guān)系。本研究對(duì)禾谷鐮刀菌FgRILP的功能及對(duì)DON毒素合成的影響進(jìn)行分析,研究結(jié)果為揭示DON毒素生物合成的分子調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ),為開發(fā)新型靶標(biāo)殺菌劑及減少真菌毒素的污染水平、保障農(nóng)產(chǎn)品食用安全性提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：河南工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S435.121.45;TQ455;TS201.6
【圖文】：

2 材料與方法 實(shí)驗(yàn)材料.1 供試菌株禾谷鐮刀菌野生型（PH-1）菌株由許金榮博士贈(zèng)予。大腸桿菌菌株 DH5α， AH109 由福建農(nóng)林大學(xué)功能基因組學(xué)研究中心王宗華研究員惠贈(zèng)。.2 致病性鑒定材料小麥種子（鄭麥矮抗 58 號(hào)）從河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院購買，西紅柿由鄭州市高小麥麥穗在鄭州高新區(qū)采摘。.3 質(zhì)粒載體pKNT-RP27-GFP、pGBKT7、pGADT7 載體，由福建農(nóng)林大學(xué)功能基因組學(xué)贈(zèng)，本實(shí)驗(yàn)室保存，質(zhì)粒圖譜如圖 1 所示。

名為 FgRILP，其 ORF 全長為 3742bp，cDNA 為 3579bp，編碼含有 1192 個(gè)氨基酸的蛋白。利用 NCBI 上的 CDD 功能對(duì) FgRILP 蛋白進(jìn)行保守域分析（圖 2），發(fā)現(xiàn) FgRILP具有多個(gè)保守域，在 175-273aa 區(qū)間有一個(gè) NST1 保守域，NST1 屬鹽耐受調(diào)節(jié)因子，推測該基因在鹽脅迫下具有調(diào)控作用；在 568-691aa 區(qū)間有一個(gè) TolA_full 的保守域結(jié)構(gòu)，TolA 將自身的內(nèi)膜復(fù)合體與 TolQ 和 TolR 偶聯(lián)到 TolB 和 Oprl 的外膜復(fù)合體（又稱 PAl），Tol-PAl 復(fù)合物是維持外膜完整性所必需的，推測該保守域與物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和致病性相關(guān)；在 577-807aa 區(qū)間有一個(gè) MIP-T3（Microtubule-binding protein）蛋白，其 N末端區(qū)域是微管結(jié)合結(jié)構(gòu)域并且是保守的，C 末端 100 個(gè)殘基也很保守，構(gòu)成了與TRAF3 結(jié)合的卷曲螺旋區(qū)。在 709-1018aa 區(qū)間存在 Atrophin-1 蛋白保守域，該蛋白在動(dòng)物中是進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病基因（Dentatorubral-pallidoluysian atrophy gene-DRPLA）的蛋白產(chǎn)物，其中 CAG（谷氨酰胺）重復(fù)序列與致病性相關(guān)，該保守域在真菌中的功能未知。

運(yùn)用 softberry 在線軟件中的 protein localization 分析顯示，該基因編碼的蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)（圖 4）。XP 003042199.1 hypothetical protein NECHADRAFT 81283 Nectria haematococca mpVI 77-13-4KKP05144.1 hypothetical protein THAR02 02739 Trichoderma harzianumXP 013947360.1 hypothetical protein TRIATDRAFT 171742 partial Trichoderma atroviride IMI 20KFG80470.1 stress response protein nst1 Metarhizium anisopliaePOR33676.1 Stress response protein NST1 Tolypocladium paradoxumPNY25131.1 Stress response protein NST1 Tolypocladium capitatum100100870.05注：禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、黃色鐮孢菌（Fusarium culmorum）、長柄鐮刀菌（Fusariulangsethiae）、黎孢鐮刀菌（Fusarium pose）、燕麥鐮孢菌（Fusarium avenaceum）、尖孢鐮刀菌（Fusariuoxysporum）、血鏈球菌（Nectria haematococca）、串珠鐮刀菌（Fusariμm verticillioides）、層生鐮刀菌（Fusariuproliferatum）、水稻惡苗病菌（Fusarium fujikμroi）、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）、綠僵菌（Metarhiziuanisopliae）、綠色木霉（Trichoderma viride）、頭狀蟲草（Tolypocladium capitatum）、大團(tuán)囊蟲草(Tolypocladiuparadoxum)。圖 3 FgRILP 系統(tǒng)發(fā)育樹FIg. 3 Phylogenetic tree of FgRILP

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本文編號(hào)：2771718