【摘要】：小麥是世界三大糧食作物之一,小麥赤霉病是世界性的重要病害,不僅造成糧食作物的減產(chǎn),還會產(chǎn)生大量真菌毒素威脅人畜安全,因此,防控小麥赤霉病具有重要意義。小麥赤霉病的病原菌主要為禾谷鐮刀菌,其產(chǎn)生的DON毒素受很多因素的調(diào)控。Rab7蛋白作為調(diào)控蛋白,可通過與上游調(diào)節(jié)子和下游效應(yīng)子結(jié)合協(xié)同發(fā)揮調(diào)控功能。RILP(Rab互作溶酶體蛋白)是Rab7的效應(yīng)因子之一。禾谷鐮刀菌中FgRab7影響DON毒素的生物合成,但FgRILP對DON毒素的影響未知。本研究對禾谷鐮刀菌FgRILP的功能進行初探。通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn),FgRILP含有鹽耐受負調(diào)控因子NST1蛋白、TolA蛋白、微管結(jié)合蛋白(MIP-T3)和Atrophin-1蛋白多個保守域;系統(tǒng)發(fā)育分析顯示,禾谷鐮刀菌PH-1的FgRILP與另一株禾谷鐮刀菌的假定蛋白、黃色鐮孢菌的脅迫反應(yīng)蛋白在同一個分支,推測該基因與鹽脅迫有關(guān)。運用同源重組技術(shù)構(gòu)建了FgRILP基因敲除和過表達突變體,對突變體進行了鹽脅迫和非脅迫下的表型分析。結(jié)果顯示,在非鹽脅迫條件下,突變體菌株與野生型的菌落形態(tài)無差異,但過表達突變體的菌絲生長更快,FgRILP敲除突變體菌絲生長減慢(p0.05);與野生型相比,FgRILP敲除突變體產(chǎn)孢量略有降低,FgRILP過表達突變體產(chǎn)孢量略有升高,FgRILP突變體和野生型的孢子萌發(fā)速率一致;FgRILP突變體和野生型均具侵染性,但FgRILP敲除突變體侵染力小于野生型和FgRILP過表達突變體,表明FgRILP基因與禾谷鐮刀菌的生長發(fā)育、產(chǎn)孢量、致病性相關(guān),對孢子的萌發(fā)和形態(tài)無影響。與非脅迫相比,在1.0M NaCl、0.08M LiCl及剛果紅脅迫后,菌絲形態(tài)更稀疏,生長速度明顯減慢(p0.01);鹽脅迫下突變體與野生型菌株產(chǎn)生的分生孢子明顯變形,產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)速率均顯著降低,FgRILP突變體的產(chǎn)孢量均低于野生型;NaCl脅迫下,FgRILP敲除突變體的菌絲生長速率比野生型生更慢(p0.05),FgRILP敲除突變體致病力弱于野生型。暗示FgRILP基因在鹽脅迫下對菌株生長、致病性等方面的調(diào)控作用。本研究進一步分析了FgRILP對DON毒素合成的影響。在小麥基質(zhì)培養(yǎng)基中,非脅迫和NaCl脅迫下,FgRILP敲除突變體的DON合成量均顯著低于野生型(p0.05);在0.08M LiCl脅下,FgRILP敲除突變體的DON合成量比野生型相稍高。在產(chǎn)毒液體培養(yǎng)基中,NaCl脅迫下,FgRILP敲除突變體的DON合成量顯著低于野生型(p0.05);在0.08M LiCl脅迫下,FgRILP敲除突變體DON毒素的合成量略高于野生型。并且經(jīng)過Tri5基因的表達量分析,發(fā)現(xiàn)在受NaCl脅迫下,其相對表達量與毒素測定結(jié)果相一致。表明FgRILP影響了禾谷鐮刀菌DON毒素的合成,在鹽脅迫下具有調(diào)控作用。本研究還利用酵母雙雜交分析了FgRILP與FgRab7的相互作用情況,結(jié)果表明,FgRILP與FgRab7沒有相互作用。但通過實時定量PCR分析兩個基因的相對表達時發(fā)現(xiàn),FgRILP在FgRab7敲除突變體中的相對表達量下調(diào),FgRab7在FgRILP敲除突變體的表達量上調(diào),可能FgRab7為了發(fā)揮調(diào)控作用,表達量上調(diào),表明二者存在一定的相互關(guān)系。本研究對禾谷鐮刀菌FgRILP的功能及對DON毒素合成的影響進行分析,研究結(jié)果為揭示DON毒素生物合成的分子調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ),為開發(fā)新型靶標殺菌劑及減少真菌毒素的污染水平、保障農(nóng)產(chǎn)品食用安全性提供了理論依據(jù)。
【學位授予單位】：河南工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S435.121.45;TQ455;TS201.6
【圖文】：

2 材料與方法 實驗材料.1 供試菌株禾谷鐮刀菌野生型（PH-1）菌株由許金榮博士贈予。大腸桿菌菌株 DH5α， AH109 由福建農(nóng)林大學功能基因組學研究中心王宗華研究員惠贈。.2 致病性鑒定材料小麥種子（鄭麥矮抗 58 號）從河南省農(nóng)業(yè)科學院購買，西紅柿由鄭州市高小麥麥穗在鄭州高新區(qū)采摘。.3 質(zhì)粒載體pKNT-RP27-GFP、pGBKT7、pGADT7 載體，由福建農(nóng)林大學功能基因組學贈，本實驗室保存，質(zhì)粒圖譜如圖 1 所示。

名為 FgRILP，其 ORF 全長為 3742bp，cDNA 為 3579bp，編碼含有 1192 個氨基酸的蛋白。利用 NCBI 上的 CDD 功能對 FgRILP 蛋白進行保守域分析（圖 2），發(fā)現(xiàn) FgRILP具有多個保守域，在 175-273aa 區(qū)間有一個 NST1 保守域，NST1 屬鹽耐受調(diào)節(jié)因子，推測該基因在鹽脅迫下具有調(diào)控作用；在 568-691aa 區(qū)間有一個 TolA_full 的保守域結(jié)構(gòu)，TolA 將自身的內(nèi)膜復合體與 TolQ 和 TolR 偶聯(lián)到 TolB 和 Oprl 的外膜復合體（又稱 PAl），Tol-PAl 復合物是維持外膜完整性所必需的，推測該保守域與物質(zhì)轉(zhuǎn)運和致病性相關(guān)；在 577-807aa 區(qū)間有一個 MIP-T3（Microtubule-binding protein）蛋白，其 N末端區(qū)域是微管結(jié)合結(jié)構(gòu)域并且是保守的，C 末端 100 個殘基也很保守，構(gòu)成了與TRAF3 結(jié)合的卷曲螺旋區(qū)。在 709-1018aa 區(qū)間存在 Atrophin-1 蛋白保守域，該蛋白在動物中是進行性神經(jīng)退行性疾病基因（Dentatorubral-pallidoluysian atrophy gene-DRPLA）的蛋白產(chǎn)物，其中 CAG（谷氨酰胺）重復序列與致病性相關(guān)，該保守域在真菌中的功能未知。

運用 softberry 在線軟件中的 protein localization 分析顯示，該基因編碼的蛋白定位在細胞質(zhì)（圖 4）。XP 003042199.1 hypothetical protein NECHADRAFT 81283 Nectria haematococca mpVI 77-13-4KKP05144.1 hypothetical protein THAR02 02739 Trichoderma harzianumXP 013947360.1 hypothetical protein TRIATDRAFT 171742 partial Trichoderma atroviride IMI 20KFG80470.1 stress response protein nst1 Metarhizium anisopliaePOR33676.1 Stress response protein NST1 Tolypocladium paradoxumPNY25131.1 Stress response protein NST1 Tolypocladium capitatum100100870.05注：禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、黃色鐮孢菌（Fusarium culmorum）、長柄鐮刀菌（Fusariulangsethiae）、黎孢鐮刀菌（Fusarium pose）、燕麥鐮孢菌（Fusarium avenaceum）、尖孢鐮刀菌（Fusariuoxysporum）、血鏈球菌（Nectria haematococca）、串珠鐮刀菌（Fusariμm verticillioides）、層生鐮刀菌（Fusariuproliferatum）、水稻惡苗病菌（Fusarium fujikμroi）、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）、綠僵菌（Metarhiziuanisopliae）、綠色木霉（Trichoderma viride）、頭狀蟲草（Tolypocladium capitatum）、大團囊蟲草(Tolypocladiuparadoxum)。圖 3 FgRILP 系統(tǒng)發(fā)育樹FIg. 3 Phylogenetic tree of FgRILP

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 張林;張夢雅;康健;閆紅飛;劉大群;;一種快速檢測小麥赤霉病菌種類的方法[J];河南農(nóng)業(yè)科學;2017年01期

2 侯昌亮;胡寒哲;艾爽;李俊凱;;11種殺菌劑對小麥赤霉病菌的抑制作用[J];湖北農(nóng)業(yè)科學;2014年17期

3 胡公洛;周麗鴻;閻月云;;河南省小麥赤霉病菌致病種的鑒定[J];豫西農(nóng)專學報;1988年02期

4 陳利鋒,徐雍皋;小麥赤霉病菌直接侵入現(xiàn)象的電鏡觀察[J];南京農(nóng)業(yè)大學學報;1989年02期

5 徐雍皋,內(nèi)藤秀樹;小麥赤霉病菌的侵染過程[J];南京農(nóng)業(yè)大學學報;1989年03期

6 段雙科;王保通;;小麥赤霉病菌單小穗接種抗擴展鑒定技術(shù)研究[J];陜西農(nóng)業(yè)科學;1989年06期

7 ;小麥赤霉病菌種的簡易擴大培養(yǎng)法[J];湖北農(nóng)業(yè)科學;1975年10期

8 顧寶根;劉經(jīng)芬;;小麥赤霉病菌對多菌靈抗藥性測定方法的探討[J];植物保護學報;1990年03期

9 王建新,周明國,陸悅健,葉鐘音;小麥赤霉病菌抗藥性群體動態(tài)及其治理藥劑[J];南京農(nóng)業(yè)大學學報;2002年01期

10 羅巧燕;曹遠銀;宋慧君;邱宏偉;范世奇;王玉坤;;小麥赤霉病菌固體培養(yǎng)基產(chǎn)毒條件研究[J];河南農(nóng)業(yè)科學;2009年05期

相關(guān)會議論文 前10條

1 紀莉景;王樹桐;胡同樂;曹克強;;對小麥赤霉病菌有抑制作用的化學藥劑及其混配研究[A];中國植物病理學會2005年學術(shù)年會暨植物病理學報創(chuàng)刊50周年紀念會論文摘要集[C];2005年

2 紀莉景;王樹桐;胡同樂;曹克強;;對小麥赤霉病菌有抑制作用的化學藥劑及其混配研究[A];中國植物病理學會2005年學術(shù)年會暨植物病理學報創(chuàng)刊50周年紀念會論文集[C];2005年

3 李偉;胡迎春;陳懷谷;張愛香;陳瑩;;我國小麥赤霉病菌部分菌株系統(tǒng)發(fā)育學分析及產(chǎn)毒素化學型檢測[A];中國植物病理學會2008年學術(shù)年會論文集[C];2008年

4 李偉;胡迎春;陳瑩;張愛香;陳懷谷;;我國小麥赤霉病菌部分菌株產(chǎn)毒素化學型檢測及系統(tǒng)發(fā)育學分析[A];江蘇省植物病理學會第十一次會員代表大會暨學術(shù)研討會論文集[C];2008年

5 胡迎春;李偉;陳懷谷;周益軍;;我國小麥主產(chǎn)區(qū)小麥赤霉病菌組成和致病力檢測[A];中國植物病理學會2009年學術(shù)年會論文集[C];2009年

6 何新航;丁克堅;陳莉;;10種殺菌劑對小麥赤霉病菌的室內(nèi)毒力測定[A];2014年中國植物保護學會學術(shù)年會論文集[C];2014年

7 祭芳;李華;徐劍宏;史建榮;;抗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的抗體制備及其檢測方法的建立[A];江蘇省植物病理學會第十一次會員代表大會暨學術(shù)研討會論文集[C];2008年

8 高先悅;高淑敏;林森;于金鳳;;山東小麥赤霉病菌的種群組成及毒素化學型分析[A];植物病理學研究進展——中國植物病理學會第十二屆青年學術(shù)研討會論文選編[C];2015年

9 倪楚芳;朱昌雄;龍厚茹;粟燕;蔣細良;宋培國;;防治小麥赤霉病的新農(nóng)抗9686[A];全國生物防治學術(shù)討論會論文摘要集[C];1995年

10 邱艷;謝益書;;小麥赤霉病菌酯酶同工酶研究[A];中國植物病理學會第七屆代表大會暨學術(shù)研討會論文摘要集[C];2002年

相關(guān)博士學位論文 前4條

1 史建榮;小麥赤霉病菌與寄主小麥的互作研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2000年

2 劉馨;小麥赤霉病菌麥角甾醇生物合成途徑中關(guān)鍵基因的功能研究[D];浙江大學;2012年

3 付靜;小麥赤霉病菌甲硫氨酸代謝途徑中關(guān)鍵基因的生物學功能研究[D];浙江大學;2012年

4 石志琦;蛇床子素作為殺菌劑的活性研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2008年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 朱麗紅;小麥赤霉病菌Rab互作溶酶體蛋白對DON毒素生物合成的影響[D];河南工業(yè)大學;2019年

2 高先悅;山東小麥赤霉病菌的種群組成和毒素化學型鑒定及對殺菌劑的敏感性分析[D];山東農(nóng)業(yè)大學;2016年

3 夏云磊;小麥赤霉病菌一個MFS基因功能和真菌病毒的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2017年

4 盧麗斌;安徽小麥赤霉病菌的遺傳多樣性和種群分布規(guī)律研究[D];安徽農(nóng)業(yè)大學;2017年

5 高淑敏;兩種殺菌劑對長江流域小麥赤霉病菌的毒力測定和抗性誘導[D];山東農(nóng)業(yè)大學;2017年

6 孫眾;小麥赤霉病菌的室內(nèi)藥劑篩選與貯藏期毒素影響因子的研究[D];安徽農(nóng)業(yè)大學;2013年

7 崔云鳳;小麥赤霉病菌對多菌靈的抗藥性及致病性缺陷菌株的回復突變檢測[D];四川農(nóng)業(yè)大學;2007年

8 戴大凱;小麥赤霉病菌多菌靈抗性群體的擴散路徑及遺傳多樣性研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2013年

9 陳驤;小麥赤霉病菌的抗藥性研究及抗性治理[D];浙江大學;2015年

10 劉方圓;抗多菌靈小麥赤霉病菌的適合度研究及一個Gal4-like基因的功能分析[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2016年

本文編號：2771718