【摘要】：水楊酸在醫(yī)藥和化妝品行業(yè)有重要的應用,而粘糠酸則是塑料和多種化學品生產的重要前體化合物。傳統(tǒng)的的生產模式在生產水楊酸和粘糠酸的過程中都會造成不可再生資源的消耗和環(huán)境污染,在這樣的大背景下,新綠色生物合成的生產方式給當代發(fā)展帶來了希望。本實驗闡述了利用微生物大腸桿菌作為宿主生物合成水楊酸和粘糠酸的菌株構建和優(yōu)化過程。在我們實驗室之前的生物合成粘糠酸和水楊酸的研究基礎,我們采用了RED基因重組的方法在大腸桿菌ATCC31884菌株的基因組上建立了一個水楊酸的高產平臺。首先選取了不同強度啟動子將合成水楊酸的基因整合到宿主細胞基因組上,通過莽草酸途徑生產水楊酸,并找到了最優(yōu)的菌株進行下一步優(yōu)化;然后敲除了水楊酸生產途徑的競爭途徑,使水楊酸的產量增加一倍;再自下而上加強水楊酸的上游途徑,為上游基因替換了強啟動子之后發(fā)現(xiàn)水楊酸的產量是加強前的兩倍;最后將菌株的水楊酸生產與細菌自身代謝生長相偶聯(lián)。一步步的優(yōu)化水楊酸的產量,最終得到水楊酸的搖瓶發(fā)酵產量為1.51 g/L。并利用該水楊酸高產平臺發(fā)酵粘糠酸,得到粘糠酸搖瓶產量為 2.6g/L。本實驗與已經報道的大腸桿菌生產水楊酸的方法不同,在水楊酸高產平臺的構建中,拋棄了質粒構建的方法,直接采用了在大腸桿菌的基因組上重組合成水楊酸的基因,使得到的水楊酸高產菌株更為穩(wěn)定,由此高產平臺發(fā)酵下游產物也更加的方便簡單。
【學位授予單位】：北京化工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：TQ245.4;TQ920.1
【圖文】：

邐邐逡逑圖２－１邋ＲＥＤ重組示意圖逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｔｈｅ邋ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｏｆ邋ＲＥＤ邋ｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ逡逑ＲＥＤ基因整合是一種比較傳統(tǒng)的同源重組的方法。逡逑１．先用Ｏｖｅｒｌａｐ邋ＰＣＲ的方法將兩個同源臂和卡那與目的基因的連接片斷連接起逡逑

圖３－１水楊酸生物合成途徑逡逑藍色箭頭代表大腸桿菌自身的途徑，紫色箭頭代表外源途徑；紅色字代表敲除基因，綠色字代表逡逑加強基因。ＰＥＰ，磷酸烯醇式丙酮酸；Ｅ４Ｐ，赤蘚糖４－磷酸；ＤＡＨＰ，邋１－羧基－２－脫氧－Ｄ－葡萄糖－６－逡逑磷酸；Ｐｙｒ，丙酮酸；ＩＣＳ，異分支酸合成酶；ＩＰＬ，異分支酸－丙酮酸裂解酶；ＰＰＡ，預苯酸；逡逑

逡逑圖３－３邋Ｔ７ＲＮＡ聚合酶重組片段制備逡逑Ｍ為５０００ｂｐ邋ＤＮＡ邋ｍａｒｋｅｒ；邋２－３為Ｔ７ＲＮＡｐ－ＫＡＮ與上下游同源臂連接片段逡逑Ｆｉｇ．邋３－３邋Ｇｅｎｅ邋ｆｒａｇｍｅｎｔ邋ｏｆ邋Ｔ７ＲＮＡｐ邋ｆｏｒ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ逡逑Ｍ邋ｉｓ邋ａ邋５０００ｂｐ邋ＤＮＡ邋ｍａｒｋｅｒ；邋２－３邋ｉｓ邋ａ邋Ｔ７ＲＮＡｐ－ＫＡＮ邋ａｎｄ邋ｕｐｓｔｒｅａｍ邋ａｎｄ邋ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ邋ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ邋ａｒｍ逡逑ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ逡逑２６逡逑

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本文編號：2770744