發(fā)布時間：2020-07-26 07:44

【摘要】：神經(jīng)酸(C24:1)是一種雙鍵在15號碳上的二十四碳一烯酸,被稱為世界上目前唯一一種具有修復(fù)受損神經(jīng)纖維并促進其再生的物質(zhì),研究表明,神經(jīng)酸可以延緩神經(jīng)衰老,促進大腦發(fā)育,對心腦血管病、免疫系統(tǒng)疾病、某些皮膚病等有較好的效果。然而人體很難合成神經(jīng)酸,主要從外界攝入,但是目前神經(jīng)酸產(chǎn)量較低,市場需求較大,因此開發(fā)神經(jīng)酸的生物合成方法具有重要的應(yīng)用價值和理論意義。本課題選用釀酒酵母作為研究對象,通過構(gòu)建產(chǎn)超長鏈單不飽和脂肪酸工程菌,探究了啟動子類型、轉(zhuǎn)錄因子以及外源添加物等對釀酒酵母超長鏈單不飽和脂肪酸合成的影響。1、構(gòu)建FAE1和KCS單基因工程菌,通過發(fā)酵結(jié)果分析,初步確定二者在超長鏈單不飽和脂肪酸延伸過程中的作用。分別采用組成型啟動子PGK和半乳糖誘導(dǎo)型啟動子GAL1構(gòu)建FAE1和KCS單基因工程菌,發(fā)酵結(jié)果表明:相比半乳糖誘導(dǎo)型啟動子GAL1,組成型啟動子PGK對FAE1和KCS的表達具有更好的效果;FAE11單基因工程菌最終促進了 C20:1和C22:1的合成,而KCS單基因工程菌可以促進C20:1、C22:1及C24:0的合成且C20:1和C22:1的含量要低于FAE1基因工程菌,表明FAE1基因在C20:1和C22:1的延伸中起主要作用,而KCS基因可能在C24的延伸過程中起主要作用。2、探究多基因聯(lián)合對神經(jīng)酸合成的影響,根據(jù)神經(jīng)酸的生物合成途徑,在單基因工程菌的基礎(chǔ)上構(gòu)建了P TEF1-KCS-TCYC-PPGK-FAE1-TCYC雙基因工程菌以探究雙基因聯(lián)合作用于超長鏈單不飽和脂肪酸的延伸,同時引入Mga2轉(zhuǎn)錄因子對釀酒酵母不飽和脂肪酸進行調(diào)控以加強神經(jīng)酸的合成途徑。發(fā)酵結(jié)果表明,在培養(yǎng)溫度為22℃的條件下培養(yǎng)4天,PTEF1-KCS-TCYC-PPGK-FAE1-TCYC 雙基因工程菌及 PTEF1-Mga2-TCYC-PPGK-KCS-TCYC-PPGK-FAE1-TCYC三基因工程菌最終檢測到神經(jīng)酸的生成。與PTEF1-KCS-TCYC-PPPGK-FAE1-TCYC雙基因酵母相比,三基因工程菌中神經(jīng)酸含量略有提高。3、優(yōu)化培養(yǎng)條件促進超長鏈單不飽和脂肪酸的合成,通過初步探究外源添加不同脂肪酸、蘋果酸、檸檬酸及生物素對神經(jīng)酸合成的影響,發(fā)酵結(jié)果表明了外源添加油酸、蘋果酸及生物素對神經(jīng)酸的合成具有較好的促進作用,通過單因素優(yōu)化,最終確定了外源分別添加油酸濃度為1.5mM、蘋果酸濃度為0.2%、生物素濃度為1.5μg/L時,對C22:1、C24:1的合成具有較好的促進作用,最終使C22:1分別提高了 31%、77%、75%,使C24:1分別提高了 206%、140%、143%。采用分段式培養(yǎng),最終確定了在28℃培養(yǎng)48h后轉(zhuǎn)移至22℃培養(yǎng)至第6天時,C22:1和C24:1的含量有較為明顯的提升,分別提高了 57%和200%。
【學(xué)位授予單位】：北京化工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：TQ645.6
【圖文】：

逑0逡逑圖１－２神經(jīng)酸結(jié)構(gòu)式逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋－２邋Ｔｈｅ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｎｅｒｖｏｎｉｃ邋ａｃｉｄ逡逑１．１．２．２邋直接提取法逡逑直接提取法是指以富含芥酸或者神經(jīng)酸的植物種子為原料，利用目標(biāo)脂肪酸特定逡逑的沸點通過蒸餾等一系列方法分離得到芥酸或yL經(jīng)酸。從油料作物種子中直接提取芥逡逑酸和神經(jīng)酸是目前國內(nèi)外主要的生產(chǎn)工藝，國內(nèi)生產(chǎn)芥酸主要是從高芥酸油菜籽出發(fā)，逡逑將混合脂肪酸通過蒸餾、結(jié)晶、萃取等手段得到高純度芥酸，具體流程如圖１－３所示：逡逑Qi躺？水：逡逑———－ｒＪｕ．邋ｉ0ｒ邋－…邐邐邋－１５ｔ邋ｒ—，逡逑合＊轅肪酸＾一４秦q媯俊鋈芙猓ⅲ⒁唬蓿В刪Х擲肜潿辰峋Х擲耄誨五危俊鮒亟峋Ь穡義縣蒎危礤嗚у義希核使齲В椋裕潁剩蓿螅恪危矗闄哄義希掊危翦危村義涎啊鯁幔�，逦Ｔｉ＂逦千捷辶x襄五五危澹五五義希耍渝澹殄�？辶x希殄濉掊邃闈哲鶀U邐§ｍｍ逡逑｜炮和

本文編號：2770486