【摘要】：番茄紅素是一種廣泛存在于自然界中的萜類衍生物。其作為一種功能性色素,目前被廣泛用于食品和保健品中,為人們提供抗癌、抗衰老等功效。番茄紅素的市場需求目前仍處于擴(kuò)張階段,相較于同屬萜類衍生物的β-胡蘿卜素,其價(jià)格居高不下。天然來源的番茄紅素面臨著植物來源受限、產(chǎn)能不穩(wěn)定,純度不高等問題。而化學(xué)合成的番茄紅素雖然廉價(jià)易得,但是其副產(chǎn)物多,尤其在合成過程中形成的雜質(zhì)對下游的應(yīng)用安全帶來了較大風(fēng)險(xiǎn),難以達(dá)到食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的使用要求。隨著生物發(fā)酵工業(yè)的日趨成熟,利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素已成為工業(yè)界的首選技術(shù)�，F(xiàn)階段,三孢布拉霉(Blakesleatrispora)是在諸多能夠合成番茄紅素的菌株中唯一實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的菌種。本課題以三孢布拉霉CBOM2014378(+)和CBOM2014379(-)為出發(fā)菌株,篩選出具有工業(yè)應(yīng)用前景的阻斷劑,并根據(jù)所選阻斷劑相應(yīng)建立了三孢布拉霉的番茄紅素高產(chǎn)突變株選育策略,還建立了一種基于低安全風(fēng)險(xiǎn)阻斷劑的發(fā)酵工藝,并在高產(chǎn)菌株基礎(chǔ)上對發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化,并經(jīng)中試驗(yàn)證。主要研究結(jié)果如下:1.阻斷劑的篩選基于現(xiàn)行的國內(nèi)外食品安全法規(guī),有針對性的篩選允許在食品工業(yè)中有殘留限量的物質(zhì),最終挑選出3種有效阻斷劑,分別為尼古丁、咪唑、吡啶,其特點(diǎn)分別為尼古丁阻斷效率高,足量添加時(shí)所產(chǎn)番茄紅素純度最高;咪唑已在國外用于工業(yè)生產(chǎn),具有相對成熟的技術(shù)使用經(jīng)驗(yàn)和市場法規(guī)接受度,其固體形態(tài)便于生產(chǎn)操作;吡啶最為廉價(jià),且是唯一一個(gè)在國內(nèi)食品安全法規(guī)中在列的物質(zhì),其使用成本和應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)相對最低,但阻斷效果最差。2.不同阻斷劑對三孢布拉霉小分子代謝的影響在分別添加上述三種阻斷劑的情況下,通過對三孢布拉霉發(fā)酵番茄紅素過程中的小分子代謝物進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)使用尼古丁作為阻斷劑的安全性風(fēng)險(xiǎn)相對較低,它不在菌體內(nèi)代謝出有害衍生物,而咪唑在菌體內(nèi)代謝出含苯環(huán)的衍生物,吡啶在菌體內(nèi)生成含氮雜環(huán)衍生物。因此最終選擇尼古丁為后續(xù)實(shí)驗(yàn)用阻斷劑。3.番茄紅素高產(chǎn)菌株的篩選通過N+誘變(+)菌,N+誘變、平陽霉素、氯化鋰復(fù)合誘變(-)菌,使用乙烯利及尼古丁為篩選劑篩選(-)菌,其中乙烯利可在尼古丁存在時(shí)釋放乙烯,從而刺激八氫番茄紅素合成酶的表達(dá),增強(qiáng)類胡蘿卜素顯色程度,后以(-)菌配對篩選(+)菌,得到高產(chǎn)菌株:BT-LYC2017802(+)菌和BT-LYC2017403(-)菌,搖瓶驗(yàn)證番茄紅素最高發(fā)酵水平為2.3 g/L左右,較初始菌株提高44.2%。4.番茄紅素高產(chǎn)菌株的50 L發(fā)酵罐小試工藝在50 L發(fā)酵罐水平建立基于新菌種的發(fā)酵工藝。以尼古丁為阻斷劑,重新確立了其基礎(chǔ)培養(yǎng)基,補(bǔ)料策略,阻斷劑添加方式等,并建立溶氧控制模型,最終得到最高達(dá)到2.02 g/L的番茄紅素產(chǎn)量,較初始發(fā)酵工藝1.21 g/L,提高了67%。通過通氣量控制,節(jié)約能耗10%。使得番茄紅素綜合成本較初始下降85%。5.番茄紅素高產(chǎn)菌株的1000 L發(fā)酵罐中試工藝驗(yàn)證基于50 L小試工藝進(jìn)行等比例放大,以溶氧為主要控制參數(shù),經(jīng)124 h發(fā)酵得到1.83 g/L的番茄紅素產(chǎn)量,工藝過程驗(yàn)證了溶氧控制模型的有效性,并確定發(fā)酵液中無尼古丁殘留風(fēng)險(xiǎn)。
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TQ920.6;TQ28
【圖文】：

１．邋１．邋１番茄紅素的理化性質(zhì)逡逑番茄紅素分子式為ｃ４0ｈ６（），有多種同分異構(gòu)體，但在自然界中多為全反式逡逑結(jié)構(gòu)，與長鏈多不飽和脂肪酸類似，其結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)不飽和鍵（圖１．１）。這逡逑種含有大量雙鍵的結(jié)構(gòu)不僅決定了番茄紅素的光吸收特性（紫外吸收峰Ａ邋ｍａｘ逡逑為４７２ｎｍ），還賦予它鮮艷的顏色和極強(qiáng)的抗氧化能力，該能力可用于碎滅單逡逑線態(tài)氧和清除體內(nèi)的自由基Ｍｌ。番茄紅素可溶于油脂和部分有機(jī)溶劑如脂肪逡逑烴、芳香烴、苯、氯仿等，不溶于水、甲醇、乙醇等極性較強(qiáng)的溶劑。其化學(xué)逡逑性質(zhì)活潑，易在富氧、紫外線照射條件下迅速氧化，而全反式結(jié)構(gòu)相對更穩(wěn)定逡逑［５－６］，因而自然提取來源的番茄紅素多為這種結(jié)構(gòu)。逡逑ｃｈ３邋ｃｈ３邋ｃｈ３邐ＩＬ逡逑ｊｌ邐ＣＨ３邋ｃｈ３邋ｃｈ３逡逑ｈ３ｃ邋ｃｈ３逡逑圖１．１番茄紅素的全反式分子結(jié)構(gòu)逡逑１．１．２番茄紅素的生理功能逡逑番茄紅素可通過清除自由基來保護(hù)ＤＮＡ和蛋白質(zhì)，進(jìn)而保證細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)逡逑態(tài)。逡逑番茄紅素可以與二氧化氮、過氧化氫等活性氧碎片之間發(fā)生氧化還原反應(yīng)逡逑來消除自由基，它還可以通過吸收被激發(fā)的電子能量生成三重態(tài)的番茄紅素，逡逑１逡逑

表２．１流動相洗脫梯度逡逑時(shí)間（ｍｉｎ）邐Ａ相：乙腈：水＝９：１邋（ｖ／ｖ）邐Ｂ相：乙酸乙ＢＳ逡逑０邐１００邐０逡逑１５邐０邐１００逡逑２５邐０邐１００逡逑２７邐１００邐０逡逑．番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)液配制及樣品前處理逡逑制番紅的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為１邋ｍｇ／Ｌ，２邋ｍｇ／Ｌ，５邋ｍｇ／Ｌ，１０ｍｇ／Ｌ，２５邋ｍｇ／ＬＬ。制作標(biāo)曲及確定出峰時(shí)間為１１．１５３邋ｍｉｎ邋（圖２．１）。逡逑�。埃埃卞澹珏澹ň_至０．０００１邋ｇ）樣品于ｌＯＯｍＬ的容量瓶中，使用乙酸乙酯度（需保證樣品完全溶解）。取出ｌｍＬ溶液置于丨ＯｍＬ容量瓶中，使用定容至刻度，混勻后過０．４５邋ｐｍ濾膜過濾后待測。逡逑９００－逡逑

尤其在通氣量大時(shí)，一次性添加可能造成不必要的損失和浪費(fèi)，且導(dǎo)逡逑致后續(xù)生物量增加時(shí)需要額外加大阻斷劑用量，因此可以在生物量的對數(shù)生長期逡逑中期、末期分兩次添加。如圖２．２所示，５０邋Ｌ發(fā)酵罐驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，生物量在４０邋ｈ左逡逑右到達(dá)平臺期，以此為依據(jù)，計(jì)劃分別在２０邋ｈ左右，４４邋ｈ左右各添加５０邋％的阻斷逡逑劑。咪唑則可以在３２邋ｈ左右一次性添加。逡逑５０逡逑４５邋■邐—ＤＣＷ邐１逡逑４０邋■邐＾ｉＪ＋Ｉ逡逑３５邐ｙｒ＼逡逑ｇ邋：邐計(jì)劃尼

本文編號：2770311