【摘要】：圓柚酮為倍半萜烯類化合物,屬雅檻藍烷系的雙環(huán)倍半萜酮。圓柚酮在低濃度時表現(xiàn)出濃郁的柚子香氣,并帶有甜橙、木香香韻,但味苦,其氣味閾值較低,僅為1μg/L。圓柚酮因具有宜人的柑橘香氣而受到人們的關(guān)注,自其被發(fā)現(xiàn)以來,關(guān)于圓柚酮的天然分布、晶體結(jié)構(gòu)及其多種立體異構(gòu)體的香味特征,都得到了廣泛的研究。由于它在天然產(chǎn)物中含量很低,而且其具有立體異構(gòu)體,幾乎無法分離得到,且提取成本很高,所以圓柚酮的提取及應用受到很大限制。目前國內(nèi)外有關(guān)瓦倫西亞橘烯生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)圓柚酮的研究還很少,本實驗研究旨在通過比較三株不同微生物菌種轉(zhuǎn)化瓦倫西亞橘烯生產(chǎn)圓柚酮的效果,篩選適于轉(zhuǎn)化瓦倫西亞橘烯生產(chǎn)圓柚酮的菌種,增加瓦倫西亞橘烯轉(zhuǎn)化生成圓柚酮的轉(zhuǎn)化量,并提高其轉(zhuǎn)化率,降低天然香料圓柚酮的生產(chǎn)成本。對產(chǎn)物圓柚酮進行分離純化,并對轉(zhuǎn)化過程中的酶進行初步探索。1.利用SPME-GC-MS技術(shù),分析檢測黑曲霉(Aspergillus niger),毛霉(Mucor sp.)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)轉(zhuǎn)化瓦倫西亞橘烯的產(chǎn)物,并比較三株菌株轉(zhuǎn)化瓦倫西亞橘烯生成圓柚酮的效果。實驗結(jié)果表明,三株菌種黑曲霉(Aspergillus niger),毛霉(Mucor sp.),解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)均能對瓦倫西亞橘烯進行轉(zhuǎn)化并生成圓柚酮,同時生成α-松油醇,香芹酮等物質(zhì)。其中解脂耶氏酵母轉(zhuǎn)化瓦倫西亞橘烯生成圓柚酮的產(chǎn)量最高,達252.52±15.79 mg/L,轉(zhuǎn)化率也最高,達27.45%±1.72%。其次為黑曲霉和毛霉,產(chǎn)量分別為140.94±30.26 mg/L和137.67±14.02 mg/L,轉(zhuǎn)化率分別為15.32%±3.29%和15.45%±3.36%。2.通過正交試驗對解脂耶氏酵母的發(fā)酵培養(yǎng)基進行條件優(yōu)化,得到培養(yǎng)基最佳優(yōu)化組合為:乳糖40 g/L,蛋白胨15 g/L,FeSO_4·7H_2O 0.6 g/L。解脂耶氏酵母具有較高的生物轉(zhuǎn)化瓦倫西亞橘烯生成圓柚酮的效果,優(yōu)化后的該菌培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化生成圓柚酮的濃度可達457.32±76.11 mg/L,轉(zhuǎn)化率為49%,較未優(yōu)化的培養(yǎng)基相比轉(zhuǎn)化率提高了21.55%。在單因素工藝優(yōu)化實驗基礎(chǔ)上,確定轉(zhuǎn)化條件研究優(yōu)化組合為添加底物的時間為菌種轉(zhuǎn)化36 h時,添加菌種的濃度為5%,添加底物濃度為920mg/L,底物添加后的轉(zhuǎn)化時間為36 h,選用水溶性有機溶劑二甲基亞砜(DMSO)做助溶劑,添加濃度為10%。轉(zhuǎn)化條件的溫度為32℃,轉(zhuǎn)速150 rpm,pH為初始5.30。最終得到產(chǎn)物圓柚酮的轉(zhuǎn)化量為531.16±21.30 mg/L,轉(zhuǎn)化率為57.73±2.31%。相比于培養(yǎng)基優(yōu)化之后圓柚酮轉(zhuǎn)化量457.32±76.11 mg/L,轉(zhuǎn)化率為49%,其轉(zhuǎn)化效率提高了8.73%,較最初轉(zhuǎn)化率提高29.92%。3.通過高速逆流色譜法(HSCCC)法對解脂耶氏酵母轉(zhuǎn)化瓦倫西亞橘烯生成的圓柚酮進行分離純化。通過使用高速逆流色譜分離純化樣品中圓柚酮成分,選擇出合適的兩相溶劑體系,確定較佳的溶劑分離條件。篩選正己烷-氯仿-乙腈、正己烷-二氯甲烷-乙腈、正己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-乙腈的3種不同比例的非水性兩相溶劑系統(tǒng)以及正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水的2種不同比例的含水兩相溶劑系統(tǒng)進行高速逆流色譜實驗�？疾旄鱾�溶劑系統(tǒng)對分離的影響,綜合考慮分離所得圓柚酮純度及洗脫時間,選擇正己烷-甲醇-水(5:4:1),以上相為固定相,下相為流動相進行洗脫,此時圓柚酮的洗脫時間為280-340 min,GC-MS分析產(chǎn)品純度為53.74%。最終進行質(zhì)譜和紅外的結(jié)構(gòu)鑒定,確定其為圓柚酮。4.本部分實驗主要是對解脂耶氏酵母的蛋白進行純化。實驗研究六種不同種類的抑制劑都會抑制生物轉(zhuǎn)化,使圓柚酮濃度下降,其中鄰二氮菲對瓦倫西亞橘烯轉(zhuǎn)化生成圓柚酮的抑制作用最強,抑制率達到12.28%。實驗測定轉(zhuǎn)化瓦倫西亞橘烯生成圓柚酮的酶即菌體活性蛋白成分大部分在菌體破碎液的上清中。用9個不同梯度的百分比含量的硫酸銨((NH_4)_2SO_4)來沉淀菌株解脂耶氏酵母的菌體破碎液,確定最佳沉淀濃度百分比為40%。
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TQ654
【圖文】：

圖 1-1 圓柚酮的分子結(jié)構(gòu)（左）以及圓柚酮的晶體結(jié)構(gòu)（右） Molecular structure of nootkatone (left) and crystal structure of nootkato于宜人的柑橘香氣，在研究中而引起了人們的普遍關(guān)注。有、晶體結(jié)構(gòu)以及多種立體異構(gòu)體的香味特征，都得到了廣泛的

圖 1-2 瓦倫西亞橘烯轉(zhuǎn)化為圓柚酮（1，瓦倫西亞橘烯；2，圓柚醇；3，圓柚酮）Fig.1-2 Conversion of valencene to nootkatone (1, valencene, 2, nootkatol, 3, nootkato圓柚酮的應用酮具有濃郁的柚類香氣，它可以作為天然的香精香料添加到食品中去作為柚類香氣的衡量指標(Shaw 1981)。近年來，圓柚酮關(guān)于生理作用越重要。它的味道除了應用于香水外，最近實驗研究發(fā)現(xiàn)圓柚酮也有毒性活動向毀滅性的地下白蟻。然而，與自然產(chǎn)品相關(guān)的當前成本使工業(yè)應用。圓柚酮作為一種天然的倍半萜酮，其對兩種主要的儲藏害米象甲具有接觸毒性和驅(qū)避性，對玉米和水稻的危害明顯小于溶劑處表明圓柚酮具有驅(qū)蟲效果，對玉米雜草的驅(qū)避率為 46.3~93.1%，水稻為 39.2~67.2%（Mao et al 2010）。研究表明，圓柚酮對福爾摩沙地下llo et al 2001; Zhu et al 2001; Ibrahim et al 2004)，以及一種攜帶萊姆病名

圖 2-3 圓柚酮標準曲線Fig.2-3 The standard curve of nootkatone利用分析純無水乙醇（分析純）對標準的圓柚酮進行稀釋，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用進行測定，以峰面積為縱坐標，以瓦倫西亞烯濃度為橫坐標進行測定。結(jié)果如

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本文編號：2762369