發(fā)布時間：2020-07-08 13:16

【摘要】：本論文課題來源于吉林省科技廳攻關項目(20160204022NY):《林蛙殘體膠原蛋白多肽的結構修飾及穩(wěn)定性關鍵技術研究》。本研究以酶解過濾得到的具有高生物活性的林蛙膠原蛋白多肽(分子量小于3500Da)為原料,對其進行分離純化及其功能性等研究。首先優(yōu)化凝膠層析分離條件得到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三個組分,利用高分辨液質聯(lián)用儀(LC-MS)鑒定其氨基酸序列,篩選出各組分的優(yōu)勢序列。其次,對Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分的抗氧化和ACE抑制活性進行研究,結合所得氨基酸序列探究抗氧化和ACE抑制活性的構效關系。最后,以林蛙膠原蛋白肽為芯材,制備林蛙肽/微孔淀粉-海藻酸鈉微膠囊,考察其在體外模擬胃腸液中的緩釋效果。本文的研究內容及對應結果如下:1.利用葡聚糖凝膠層析分離技術分離純化林蛙膠原蛋白多肽,對層析介質規(guī)格、上樣量和洗脫流速三個主要條件進行優(yōu)化,得到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分,再對各組分多肽形貌進行掃描電鏡分析,最后將三個組分進行LC-MS檢測得到各組分的優(yōu)勢氨基酸序列。結果如下:(1)層析分離條件為:層析介質SephadexG25、上樣量1500μg、洗脫流速60mL/h時分離效果最好,得到三個組分。(2)混合肽及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的掃描電鏡分析結果表明:原混合肽表面形貌呈圓球狀,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分表面形貌相似,均是絮狀,片狀和棒狀的混合,彼此間差異不明顯。(3)從LC-MS檢測所得氨基酸序列中,篩選出Ⅰ組分中的優(yōu)勢氨基酸序列有NMDMPPNK、LDAQVSALEGAR、LEVLEIIMAIFK,分別命名為Ⅰ_1、Ⅰ_2、Ⅰ_3;Ⅱ組分中的優(yōu)勢氨基酸序列有NALSPLK、MLDEVPK、MNAQNVGK,分別命名為Ⅱ_1、Ⅱ_2、Ⅱ_3;Ⅲ組分中的優(yōu)勢氨基酸序列有GGLVGIK、EISSLK、MAAISPK、MANSQLK,分別命名為Ⅲ_1、Ⅲ_2、Ⅲ_3、Ⅲ_4。2.對分離所得的多肽組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ進行抗氧化活性研究,考察了其對DPPH的清除能力、超氧陰離子的清除能力和還原力,并進一步探索其抗氧化構效關系。結果表明:(1)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分對DPPH清除率分別為74.3%、50.8%、59.0%;還原力分別為0.68、0.32、0.33;超氧陰離子清除率分別為33.4%、12.4%、11.5%,總體來講,I的抗氧化活性最高。(2)LC-MS檢測結果表明三個組分氨基酸序列都含有Leu,Pro,Lys、Arg,這可能是三個組分均有抗氧化活性的主要原因。(3)Ⅰ中優(yōu)勢序列的N端為Leu和酸性氨基酸的酰胺殘基天冬酰胺Asn,而Ⅱ、Ⅲ中優(yōu)勢序列的N端多為中性氨基酸Met,這可能是Ⅰ組分抗氧化活性略高于Ⅱ、Ⅲ組分的原因。3.利用高效液相測定Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分多肽的ACE抑制活性,并探索其ACE抑制構效關系。結果表明:抑制劑濃度在0~10 mg/mL之間時,隨著抑制劑濃度增大,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分ACE抑制率均逐漸增高,且Ⅲ組分的ACE抑制活性始終大于I、Ⅱ組分。LC-MS檢測得出的I、Ⅱ、Ⅲ的優(yōu)勢氨基酸序列中,每個組分的優(yōu)勢序列C末端均為Lys或Arg,并且每個序列其C末端三肽位置至少含有一個疏水性氨基酸,這可能是三個組分均具有ACE抑制活性的主要原因。而Ⅲ組分的ACE抑制活性最高,可能是因為其分子量小,具有活性位點暴露多、分子移動快等特點。4.為提高林蛙膠原蛋白多肽在胃腸液內的生物利用率,增強其緩釋效果,以海藻酸鈉為壁材,微孔淀粉作吸附芯材的載體,利用銳孔凝固浴法制備了微膠囊,在體外模擬胃腸液的實驗結果顯示:林蛙肽/微孔淀粉-海藻酸鈉微膠囊與林蛙肽-海藻酸鈉微膠囊在模擬胃液中4h時,累積釋放量分別為32%和41%,在模擬腸液中8h時,累積釋放量分別為88%和83.6%。有載體的微膠囊在胃液中釋放少,在腸液中釋放量增加緩慢,說明有載體的微膠囊能起到一定的緩釋作用。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TQ464.7
【圖文】：

圖 2-1 不同條件下的洗脫峰Figure 2-1 Elution peaks under different conditions(a) 層析介質 Sephadex G15，上樣量 1000μg，流速 45mL/h；(b) 層析介質 Sephadex G25，上樣量 1000μg，流速 45mL/h；(c) 層析介質 Sephadex G25，上樣量 1500μg，流速 45mL/h；(d) 層析介質 Sephadex G25，上樣量 2000μg，流速 45mL/h；(e) 層析介質 Sephadex G25，上樣量 1500μg，流速 60mL/h；。2.4.1.1 層析介質規(guī)格的選擇上圖 2-1 中的 a、b 分別表示 Sephadex G15 和 Sephadex G25 這兩種層析介質規(guī)格下所得的不同洗脫峰。不同型號的層析介質出現(xiàn)了不同的洗脫峰形狀，表明不同層析介質規(guī)格有不同的分離純化效果。而其他分離條件一致，均為檢測波長220 nm，層析柱規(guī)格為 2.8 cm×80 cm，上樣量為 1000μg，流動相速度 45 mL/h

圖 2-2 掃描電鏡圖 A,a 混合組分；B,b.Ⅰ組分；C,cⅡ組分；D,dⅢ組分Figure 2-2 Scanning electron micrograph A, a mixed component; B, b.I component; C, cII component; D, dIII component2.4.3 各組分多肽氨基酸序列分析將Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分進行高分辨液質聯(lián)用后，通過蛋白質庫搜索匹配，得知本實驗中的林蛙膠原多肽原材料中所含蛋白質種類與種屬 Xenopus tropicalis(非洲爪蟾）匹配度高，經(jīng) Thermo Proteome Discoverer 2.2 分析軟件得出上百條氨基酸序列與其對應的信息。其中測序軟件分析所得的 Score Sequest HT 值越高表示可信度越高，測試結果越準確。氨基酸序列的 PSMs 數(shù)值越大表示該氨基酸序列的質譜圖數(shù)目越多，該氨基酸序列在整個測試中出現(xiàn)的頻率高，在整個樣品中含量占比越大。本實驗中以可信度與氨基酸序列的含量為依據(jù)，篩選出Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組

23圖 2-3 Ⅰ1NMDMPPNK 質譜圖（a）一級譜圖 (b）二級譜圖Figure 2-3 I1NMDMPPNK mass spectrum (a) primary spectrum (b) secondaryspectrum

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 鄭敏捷;朱俊萍;趙振河;莫紅春;;玫瑰香型微膠囊香味劑的制備[J];河北紡織;2011年02期

2 陸剛;;淺說織物整理微膠囊特種功能的典型應用[J];乙醛醋酸化工;2019年03期

3 王寒;羅慶華;魏夢雅;王建文;;大鯢油微膠囊的貯藏穩(wěn)定性研究[J];中國油脂;2018年11期

4 黃秀娟;;微膠囊化油脂的生產(chǎn)技術[J];糧油食品科技;2006年03期

5 劉大鑫;林小楓;吳兆強;董亦森;;微膠囊發(fā)泡劑的合成研究[J];廣州化工;1988年03期

6 曹英敏;具有特殊功效的微膠囊制劑[J];化工進展;1989年04期

7 周秀琴;微膠囊在食品開發(fā)中的應用[J];食品研究與開發(fā);1989年04期

8 高韻苕;汪斌和;;殺蟲劑微膠囊化后安全性比較及其機理的探研[J];醫(yī)學動物防制;1989年02期

9 趙鮮濤;肖超鵬;陸少鋒;;香精微膠囊的制備研究進展[J];紡織科技進展;2019年07期

10 符輝;張俊豐;黃妍;田凱勛;趙令葵;;粒徑精確調控的微膠囊催化材料制備及應用[J];環(huán)境工程學報;2018年11期

相關會議論文 前10條

1 周冠華;楊幼慧;;雙歧桿菌微膠囊化的研究進展[A];第三屆“益生菌、益生元與健康研討會”論文集[C];2004年

2 張國棟;馬力;黃寬超;;生姜油樹脂微膠囊化的研究[A];中國西部農產(chǎn)品加工及產(chǎn)業(yè)化發(fā)展戰(zhàn)略研討會論文集[C];2001年

3 田云;盧向陽;何小解;黃成江;羅澤民;;微膠囊化兒茶素的制備[A];中國科學技術協(xié)會2004年學術年會海南分會場“中國生態(tài)藥業(yè)與藥谷建設”論文集[C];2004年

4 高瓊芝;王正輝;;毒死蜱的微膠囊化及其生物效應[A];中國化學會第27屆學術年會第05分會場摘要集[C];2010年

5 李柱;羅昌榮;;噴霧干燥法制備耐高溫型微膠囊化甜橙油[A];2006年中國香料香精學術研討會論文集[C];2006年

6 薛峰;鄭向軍;黃曉青;;噴霧干燥微膠囊化中的玻璃體形成理論[A];北京食品學會青年科技論文集[C];1992年

7 敖慧君;黃清松;;維生素E微膠囊的制備工藝研究[A];2016年廣東省藥師周大會論文集[C];2015年

8 王雯;張世鋒;張偉;李建章;;微膠囊化聚磷酸銨的制備及其在木塑復合材料中的應用[A];北京粘接學會第二十三屆學術年會暨粘接劑、密封劑技術發(fā)展研討會論文集[C];2014年

9 張娜;郭慶啟;趙新淮;;微膠囊化蛋白酶在干酪制備中的應用及干酪成熟過程中電泳分析[A];中國食品科學技術學會第十一屆年會論文摘要集[C];2014年

10 王懿;萬賢;徐軍;張寅平;王馨;郭寶華;;相變蓄能材料的微膠囊化研究[A];制冷空調新技術進展——第四屆全國制冷空調新技術研討會論文集[C];2006年

相關博士學位論文 前10條

1 周淑千;微膠囊發(fā)泡劑制備及機理與應用研究[D];合肥工業(yè)大學;2018年

2 李孟軒;消脂微膠V⒃匾┨鬧锏母春轄峁股杓坪托閱苧芯縖D];天津工業(yè)大學;2018年

3 廖科超;丁烯氟蟲腈微膠囊的制備及其性能研究[D];山東農業(yè)大學;2017年

4 劉堯;基于水性聚氨酯殼材相變儲能微膠囊的制備與性能研究[D];青島科技大學;2018年

5 吳彩娥;獼猴桃籽油α-亞麻酸的富集及獼猴桃籽油微膠囊化技術研究[D];西北農林科技大學;2005年

6 陳幼芳;疏水性藥物微膠囊的自組裝構筑及其緩釋性能研究[D];浙江大學;2006年

7 熊聯(lián)明;微膠囊紅磷阻燃劑的制備、應用及阻燃抑煙機理研究[D];中南大學;2004年

8 冷延國;明膠微膠囊化技術研究[D];北京化工大學;1999年

9 趙慶賀;層狀結構生物相容微膠囊的制備及其藥物傳輸性能[D];浙江大學;2006年

10 仝維捚;新結構聚電解質微膠囊的制備與性能研究[D];浙江大學;2007年

相關碩士學位論文 前10條

1 王月月;洋蔥綜合提取物微膠囊制備技術及其干燥前處理的影響[D];河南科技大學;2019年

2 趙靜;林蛙膠原蛋白多肽的分離純化、功能性研究及其微膠囊的制備[D];吉林大學;2019年

3 丁蔚健;微膠囊化學自修復體系緩蝕性能及作用機理研究[D];深圳大學;2018年

4 金海東;微膠囊自修復水泥基材料滲透性修復效果及其評定[D];浙江工業(yè)大學;2018年

5 張松;2-苯乙醇及復合芯材微膠囊的制備、結構及穩(wěn)定性能研究[D];海南大學;2017年

6 Mohamed Gibril Bah;復合微膠囊的制備[D];天津大學;2018年

7 宋云飛;有機可逆熱致變色材料微膠囊的制備及性能研究[D];天津大學;2018年

8 黃熙鶯;富含ω-3/ω-6脂肪酸微膠囊化及應用于中老年配方奶粉的研究[D];浙江科技學院;2019年

9 鐘風靖;液驅同軸流動聚焦技術制備農藥微膠囊的實驗研究[D];中國科學技術大學;2018年

10 陳婉毓;海藻酸鈉/脲醛樹脂復合微膠囊的制備及緩釋動力學特性研究[D];華東理工大學;2019年

本文編號：2746586