【摘要】：高溫厭氧菌因其底物利用范圍廣,具有利用多糖、寡糖和多種單糖(五碳糖,六碳糖)發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的能力,是當(dāng)前生物乙醇領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本研究以Thermoanaerobacterium calidifontis Rx1及其乙酸激酶基因(ack)敲除菌株T.calidifontis Rx1△ack為研究對(duì)象,研究了其利用乳清生產(chǎn)乙醇的特性,并優(yōu)化了最佳乙醇發(fā)酵條件。同時(shí)為了研究突變菌株△ack的乙醇耐受機(jī)理,分析了乙酸激酶基因的敲除對(duì)代謝產(chǎn)物的分布和碳中心代謝關(guān)鍵酶活性的影響。1.Rx1菌株利用乳清的乙醇代謝及其發(fā)酵條件的優(yōu)化乳清作為干酪生產(chǎn)的副產(chǎn)物,大多未被合理利用。本研究利用高溫厭氧菌Rx1及其突變株Rx1△ack菌株進(jìn)行發(fā)酵乳清生產(chǎn)乙醇研究。首先通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)初步確定了影響乙醇發(fā)酵過(guò)程的主要因素有:接種量、乳糖濃度、發(fā)酵pH和發(fā)酵溫度。再通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以發(fā)酵終點(diǎn)pH,底物利用率、乙醇產(chǎn)量和乙醇得率等為指標(biāo),最終確定了乙醇發(fā)酵的最佳條件為底物濃度為20g/L、pH值為8.5,發(fā)酵溫度為60℃,接種量為8%。利用發(fā)酵罐(3L)在優(yōu)化的發(fā)酵條件下,野生型和突變菌株乙醇產(chǎn)量分別達(dá)到3.903 g/L和4.093 g/L;得率分別為0.363 g/g和0.228 g/g;乳糖利用率分別為72%和80%。2.乙酸激酶基因敲除對(duì)Rx1菌株乙醇耐受性的影響本研究發(fā)現(xiàn)突變Rx1△ack菌株的乙醇耐受性比起野生型菌株提高了2%。分析不同乙醇體積分?jǐn)?shù)的條件下,Rx1及Rx1△ack產(chǎn)物分布和碳中心代謝關(guān)鍵酶活性,為高溫厭氧菌乙醇耐受性的生化機(jī)理研究提供了一定的理論依據(jù)。添加外源乙醇,對(duì)野生型乳酸、乙酸、乙醇的產(chǎn)量影響較大,不含乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為2.011g/L、1.078 g/L、1.796 g/L,添加外源乙醇其產(chǎn)量分別下降了27%、36%和58%。突變株由于乙酸激酶基因的敲除,添加外源乙醇對(duì)其影響不大,但乳酸產(chǎn)量在4%乙醇體積分?jǐn)?shù)時(shí)產(chǎn)量最高,為2.009 g/L;乙醇產(chǎn)量在3%乙醇體積分?jǐn)?shù)條件下最高,為2.249 g/L。相比不添加外源乙醇的條件下,野生型在3%乙醇體積分?jǐn)?shù)的條件下PK酶活性最高,比起不含乙醇條件下提高了63%;在4%乙醇體積分?jǐn)?shù)下LDH、ADH、ALDH酶活性最高,分別提高了150%、130%、91%。ACK酶活性沒(méi)有顯著變化。突變株P(guān)K、LDH、ALDH酶活性在不含外源乙醇條件下最高,分別為7.798 U、1.023 U、0.840 U;ADH酶活性在乙醇體積分?jǐn)?shù)為4%時(shí)達(dá)到最大為0.581 U;ACK酶活性沒(méi)有顯著變化。3.Rx1菌株基因敲除遺傳操作系統(tǒng)構(gòu)建的探索目前很難找到高溫條件下性能穩(wěn)定的篩選標(biāo)記來(lái)構(gòu)建合適的打靶載體,即使是耐高溫的卡那霉素,其有效抗性在48-50℃只能保持48h左右,無(wú)法有效篩選只有更高溫度下才能生長(zhǎng)的陽(yáng)性重組子,有必要開(kāi)發(fā)營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記基因的篩選標(biāo)記。由于要轉(zhuǎn)化多個(gè)基因,需建立一個(gè)可以重復(fù)使用的標(biāo)記基因,營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記基因pyrF可重復(fù)使用且操作方法簡(jiǎn)單成熟。乳清酸核苷5-磷酸脫羧酶(PyrF;Orotidine5'-phosphatedecarboxylase)為乳清酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶,影響尿嘧啶的合成,可用5-氟乳清酸(5-FOA)篩選。我們構(gòu)建了pyrf基因的敲除質(zhì)粒PMU1101,期望得到工程菌株,遺憾的是未能成功篩選到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。我們推測(cè)主要原因是高溫厭氧菌特殊的細(xì)胞膜構(gòu)造和T.calidifontis Rx1感受態(tài)質(zhì)量阻礙了外源基因的轉(zhuǎn)化所致。
【學(xué)位授予單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：TQ920.6;TQ223.122
【圖文】：

物熱力學(xué)效率是取決于各種因素,包括等輔因子的濃度：NAD+、NADP+、NADNADPH、Acetyl-CoA、HS-CoA、AMP、ADP、ATP 和 PPi 以及碳中間產(chǎn)物產(chǎn)物的濃度。反應(yīng)的熱力學(xué)可以通過(guò)進(jìn)一步調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的溫度和 pH 值[28]。演示了丙酮酸異化的各種途徑進(jìn)行了討論。

Ozmihci 等[64]采用純培養(yǎng)法，以不同濃度乳清溶液培養(yǎng)馬克思克魯維酵母發(fā)酵乙醇，最大生產(chǎn)速率為 0.54 gEl-1h-1。但是利用高溫厭氧菌進(jìn)行乳清發(fā)酵的研究很少，大部分是利用木質(zhì)纖維素的研究，其產(chǎn)量不高。Papanek 等[51]以預(yù)處理的柳枝稷為底物，利用熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)發(fā)酵乙醇，野生型產(chǎn)量為 9.1 mM，突變菌株 AG553(Δhpt ΔhydG Δldh Δpfl Δpta-ack)為 16.6 mM。本研究通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件，Rx1 和 Rx1 △ack 分別在 24 h 和 20 h 達(dá)到最大乙醇濃度，產(chǎn)量分別為 3.903 g/L 和 4.093 g/L。得率分別為 0.363 g/g 和 0.228 g/g；乳糖利用率72%和80%；野生型乳酸和乙酸產(chǎn)量0.268 g/L和0.182 g/L，突變菌分別為0.169g/L 和 0.098 g/L。乳酸和乙酸產(chǎn)量顯著降低。2.4 本章小結(jié)圖 2.1 Rx1 利用發(fā)酵罐生產(chǎn)乙醇Figure 2.1 Rx1 produce ethanol in fermenter

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 申冬玲;尚淑梅;李衛(wèi)娜;嚴(yán)金平;伊日布斯;;ack基因敲除對(duì)Thermoanaerobacterium calidifontis Rx1發(fā)酵代謝的影響[J];中國(guó)生物工程雜志;2015年07期

2 蔡文飛;嚴(yán)金平;趙立峰;伊日布斯;;嗜熱厭氧菌乙醇耐受機(jī)制的研究進(jìn)展[J];中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志;2011年02期

3 徐麗麗;沈煜;鮑曉明;;釀酒酵母纖維素乙醇統(tǒng)合加工(CBP)的策略及研究進(jìn)展[J];生物工程學(xué)報(bào);2010年07期

本文編號(hào)：2734114