【摘要】：單寧酶(EC 3.1.1.20),全稱單寧�；饷�(Tannin Acyl Hydrolase),是一類能夠水解沒食子單寧分子中的酯鍵、縮酚鍵和糖苷鍵,生成葡糖糖和沒食子酸及其他醇類化合物。另外,單寧酶能水解表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG),還可以催化沒食子酸丙酯的合成,它在食品、化工、飼料、醫(yī)藥等領(lǐng)域都有重要應(yīng)用。我們發(fā)現(xiàn)茶樹內(nèi)生真菌菌核青霉AHAUCHA 001具有產(chǎn)生單寧酶的能力,我們對該菌的產(chǎn)酶條件進(jìn)行了研究,并對該菌所產(chǎn)單寧酶進(jìn)行了分離純化,研究了相關(guān)的酶學(xué)性質(zhì),研究結(jié)果報(bào)告如下。對菌核青霉AHAUCHA 001固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)單寧酶工藝參數(shù)進(jìn)行了研究:培養(yǎng)時(shí)間72 h,鹽溶液pH6.0,培養(yǎng)溫度28℃,五倍子粉含量40%(w/w),額外添加氯化銨2%(w/v),不添加額外碳源,接種量2 mL(4×10~7個(gè)孢子/mL),經(jīng)過優(yōu)化后單寧酶酶活達(dá)到131.01 U/gds,是優(yōu)化前的6.26倍。菌核青霉AHAUCHA 001菌株液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)單寧酶參數(shù)優(yōu)化:培養(yǎng)時(shí)間96 h,鹽溶液pH6.0,培養(yǎng)溫度31℃,單寧酸含量1%(w/v),0.4%(w/v)的硝酸鈉作為氮源,可溶性淀粉2%(w/v)作為碳源,轉(zhuǎn)速180 r/min,經(jīng)過優(yōu)化后單寧酶酶活為42.11U/mL,是優(yōu)化前的12.20倍。采用硫酸銨沉淀法、分子篩層析法(葡聚糖凝膠G-100)、離子交換層析法(DEAE-纖維素)部分純化單寧酶,最終的酶活力回收率為16.84%,純化倍數(shù)4.77倍。實(shí)驗(yàn)單寧酶由572個(gè)氨基酸組成,相對分子質(zhì)量為62.396 KDa,預(yù)測等電點(diǎn)為4.66。酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明,菌核青霉AHAUCHA 001所產(chǎn)單寧酶的最適反應(yīng)溫度為40℃,熱穩(wěn)定性良好。單寧酶催化反應(yīng)的最佳pH為5.0,在pH5.0-7.0之間的穩(wěn)定性較好。以沒食子酸丙酯為底物時(shí),Km為0.929 mmol/L,Vmax為102.041μmol/L·min。有機(jī)溶劑對單寧酶催化活性具有一定的影響,除丙酮的影響不顯著以外,其他有機(jī)溶劑在一定程度上降低了單寧酶的活性,其中甘油的抑制作用最為明顯,抑制率達(dá)19.87%。與文獻(xiàn)報(bào)道相比,本研究表明,在最佳的條件下,菌核青霉AHAUCHA 001是一種具有實(shí)用價(jià)值的單寧酶生產(chǎn)菌株。
【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：TQ925
【圖文】：

(b)沒食子酸(Gallic acid) (c)鞣花酸(Ellagic acid)圖 1.1 1，2，3，4，6-O-五沒食子酰葡萄糖、沒食子酸和鞣花酸分Fig.1.1Molecular structure of 1,2,3,4,6-O-pentagalloyl glucose、Gallic acid an物對單寧的抗性工業(yè)生產(chǎn)中，人們從自然中提取了很多天然化合物，利用它保質(zhì)期，植物中的單寧物質(zhì)亦有此功能。研究表明，不同種，其中，水解型單寧的抑菌能力比縮合單寧能力稍強(qiáng)一點(diǎn)，，其對寄生蟲的入侵也具有一定抵抗能力[10]。彭凱[11]對豆科行了研究，結(jié)果表明，該植物中的單寧物質(zhì)具有較強(qiáng)抗菌活合能力，顯著提高了青貯發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)，同時(shí)也改善了動很多微生物對單寧具有一定的抗性，有些霉菌甚至能通過攝生長。這是由于這部分微生物能夠產(chǎn)生某些胞外化合物，與而提高其對單寧物質(zhì)的耐受能能力。還有一些微生物能產(chǎn)生物質(zhì)，使其分解成小分子化合物，從而提高自身對丹寧物質(zhì)的

中心顏色較深，邊緣顏色較淺，有滲出液。菌落質(zhì)地為束狀和絮狀(圖4.1.a)。對菌核青霉 AHAUCHA 001 進(jìn)行顯微觀察發(fā)現(xiàn)其菌絲各細(xì)胞之間有橫隔膜，分生孢子梗頂端生有帚狀枝，在瓶梗上著生分生孢子鏈，分生孢子為球形，呈綠色(圖 4.1.b，c)。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期對該菌株進(jìn)行的分子生物學(xué)鑒定，進(jìn)一步證明該菌株為菌核青霉。根據(jù)這一結(jié)果，按照中國典型培養(yǎng)物保藏中心樣品要求制作斜面，送樣進(jìn)行保藏。4.1.2 菌核青霉 AHAUCHA 001 產(chǎn)單寧酶能力的驗(yàn)證菌核青霉 AHAUCHA 001 在含單寧酸的孟加拉紅培養(yǎng)基上培養(yǎng) 3 d 后，菌落周圍的單寧酸被水解，產(chǎn)生明顯透明圈(圖 4.1.d)。說明菌核青霉 AHAUCHA 001 在生長過程中能夠產(chǎn)生胞外單寧酶將菌落周邊的單寧酸水解并加以利用。圖 4.1 菌核青霉 AHAUCHA 001 形態(tài)及產(chǎn)單寧酶鑒定Fig.4.1.Culture and microscopic characteristics of AHAUCHA 001 and the identification of the ability of producing tannase圖注:其中 b、c 是用數(shù)碼顯微鏡拍攝的圖片，放大倍數(shù)為 400。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2725878