【摘要】：粘細(xì)菌是自然界中廣泛存在的具有復(fù)雜的多細(xì)胞行為的革蘭氏陰性細(xì)菌,具有滑動(dòng)的特點(diǎn),受多種信號(hào)途徑的調(diào)控。粘細(xì)菌次級(jí)代謝產(chǎn)物豐富,具有多樣性與生物活性,很多次級(jí)代謝產(chǎn)物擁有很大的應(yīng)用價(jià)值,其在藥物開(kāi)發(fā)中的吸引力僅次于放線菌。但是由于其具有聚團(tuán)生長(zhǎng)、代時(shí)長(zhǎng)的特點(diǎn),且培養(yǎng)及遺傳操作困難,因此其基因功能和天然化合物生產(chǎn)能力得不到有效開(kāi)發(fā),這嚴(yán)重影響了粘細(xì)菌的研究進(jìn)展。纖維堆囊菌是一類能降解纖維素的粘細(xì)菌,其次級(jí)代謝產(chǎn)物埃博霉素是一類具有抗腫瘤活性的聚酮類的大環(huán)內(nèi)酯類化合物。埃博霉素具有促進(jìn)微管聚合、抑制其解聚的活性,對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制與抗癌藥物紫杉醇的相似,但相比于紫杉醇,埃博霉素具有水溶性好,細(xì)胞毒性更小的優(yōu)點(diǎn),這引起了廣大研究者對(duì)埃博霉素的關(guān)注與研究。目前,國(guó)外已將埃博霉素的衍生物應(yīng)用到臨床,但由于埃博霉素的生產(chǎn)技術(shù)不成熟,產(chǎn)量低,導(dǎo)致埃博霉素的應(yīng)用和開(kāi)發(fā)受到限制。引起這一現(xiàn)象主要原因在于纖維堆囊菌的代時(shí)長(zhǎng)、培養(yǎng)及遺傳操作困難、細(xì)胞產(chǎn)量低,因此本實(shí)驗(yàn)室主要從埃博霉素基因簇的遺傳操作和埃博霉素的發(fā)酵優(yōu)化兩方面解決這一問(wèn)題。近些年,油酯類物質(zhì)被廣泛應(yīng)用到生物發(fā)酵的過(guò)程中,其中包括一些抗生素的生物發(fā)酵。已經(jīng)報(bào)道的可添加植物源油酯進(jìn)行發(fā)酵的抗生素主要有:紅霉素、泰樂(lè)菌素、多殺菌素、頭孢菌素C以及其他的抗生素,且它們的產(chǎn)量均得到不同程度提高。本課題研究了油酯類物質(zhì)對(duì)埃博霉素產(chǎn)量的影響并初步探索其影響機(jī)制,本課題所使用的發(fā)酵菌株均是由本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)對(duì)埃博霉素基因簇的遺傳操作獲得的高產(chǎn)突變菌株。本研究的工作主要包括三部分:一、探究油酯類物質(zhì)對(duì)突變菌株發(fā)酵埃博霉素能力的影響根據(jù)前期對(duì)埃博霉素基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化,最終確定培養(yǎng)基組分為:酪蛋白胨 1%,酵母浸提粉 0.5%,MgSO4·7H2O0.1%,MOPS10mM,吸附樹(shù)脂 2%(v/v),pH7.5。對(duì)突變菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),30℃,200rpm培養(yǎng)8d檢測(cè)出埃博霉素的產(chǎn)量在1.5 mg/L左右。在已優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加油酸甲酯和油酯類物質(zhì)均能提高埃博霉素的產(chǎn)量,其產(chǎn)量提高到10 mg/L左右。油酯類物質(zhì)的添加解決了埃博霉素產(chǎn)量低且不易被檢測(cè)的問(wèn)題。二、油酯類物質(zhì)的不同添加方式對(duì)突變菌株發(fā)酵埃博霉素的影響將油酯類物質(zhì)混合添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中,埃博霉素的產(chǎn)量提高,其中混合添加油酸甲酯和菜籽油的提高效果最好,埃博霉素產(chǎn)量提高到15 mg/L。若分批添加發(fā)酵所需最佳的油量,發(fā)現(xiàn)分批添加油酯類物質(zhì)并沒(méi)有進(jìn)一步提高埃博霉素產(chǎn)量。在Oh添加油酯類物質(zhì),發(fā)酵一段時(shí)間后補(bǔ)加油酯類物質(zhì),發(fā)現(xiàn)補(bǔ)加少量的油酯類物質(zhì)能進(jìn)一步提高埃博霉素的產(chǎn)量,使埃博霉素產(chǎn)量高于15 mg/L。若分批補(bǔ)料添加不同濃度油酯類物質(zhì),花生油的作用效果優(yōu)于其他的油酯類物質(zhì),花生油以0.2%的濃度分批添加時(shí)埃博霉素的產(chǎn)量最高,可達(dá)18 mg/L。在分批補(bǔ)料添加不同濃度油酯類物質(zhì)的同時(shí)添加適量的丙酸鈉和微量元素均能提高埃博霉素的產(chǎn)量。三、初步探索油酯類物質(zhì)提高埃博霉素產(chǎn)量的機(jī)制通過(guò)檢測(cè)添加油酯類物質(zhì)發(fā)酵過(guò)程中菌體濃度的變化、埃博霉素產(chǎn)量的變化、埃博霉素基因簇轉(zhuǎn)錄水平和菌體脂肪酶含量的變化,初步探索油酯類物質(zhì)在發(fā)酵過(guò)程中的影響機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn),油酯類物質(zhì)的添加提高了發(fā)酵液的菌體濃度,促進(jìn)了菌體的生長(zhǎng),延長(zhǎng)了菌體穩(wěn)定期。RT-qPCR結(jié)果顯示,油酯類物質(zhì)的添加促進(jìn)了埃博霉素基因簇轉(zhuǎn)錄水平的提高,且各個(gè)模塊基因的轉(zhuǎn)錄量均提高顯著。利用ELISA雙抗夾心法,檢測(cè)到油酯類物質(zhì)發(fā)酵過(guò)程中脂肪酶含量的變化情況,根據(jù)檢測(cè)結(jié)果可以得知添加油酯類物質(zhì)提高了脂肪酶的含量,為后續(xù)研究油酯類物質(zhì)的作用機(jī)制提供了參考。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：TQ920.6
【圖文】：

其營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞呈桿狀，長(zhǎng)度在３－６｜ｉｍ之間，寬度為０．７－１．０叫１［３］。粘細(xì)菌能在固逡逑體表面滑動(dòng)，并且具有復(fù)雜的多細(xì)胞行為。當(dāng)在饑餓的環(huán)境下無(wú)法獲得充足的營(yíng)逡逑養(yǎng)物質(zhì)時(shí)粘細(xì)菌會(huì)形成特異的子實(shí)體（圖１－１）。這些子實(shí)體能夠形成接近１０５逡逑個(gè)個(gè)體，并且不同種屬間的個(gè)體從它們的長(zhǎng)度，形狀和顏色上表現(xiàn)出廣泛的差異逡逑性［５］。逡逑圖１－１邋ａ圖表示粘細(xì)菌的子實(shí)體；ｂ圖是粘細(xì)菌在酪蛋白胨平板上的形態(tài)［６］逡逑粘細(xì)菌是種好氧異養(yǎng)型菌，在其的研究初期人們認(rèn)為粘細(xì)菌不能在液體環(huán)境逡逑中培養(yǎng)，后被證明此觀點(diǎn)是錯(cuò)誤的。雖然粘細(xì)菌在環(huán)境中普遍存在，并且在一些逡逑極端環(huán)境下也能生長(zhǎng)，但是只有在營(yíng)養(yǎng)豐富的條件下，粘細(xì)菌才呈現(xiàn)出良好的生逡逑長(zhǎng)狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)室中常用蛋白胨、酵母粉、大豆粉等營(yíng)養(yǎng)成分較豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充逡逑當(dāng)粘細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)原料。經(jīng)研宄發(fā)現(xiàn)，粘細(xì)菌的最佳發(fā)酵溫度為２８°Ｃ－３０°Ｃ，ｐＨ為逡逑７．０－８．０之間晸。在粘細(xì)菌的培養(yǎng)過(guò)程中存在聚團(tuán)生長(zhǎng)、菌落生長(zhǎng)緩慢、不能形逡逑１逡逑

要包括：肽類、大環(huán)、芳香族等。逡逑由德國(guó)國(guó)家生物技術(shù)研宄中心（ＧＢＦ）對(duì)粘細(xì)菌收集的結(jié)果顯示，粘細(xì)菌種逡逑類繁多，大約分離出７０００株（圖１－２），根據(jù)利用的底物不同主要可以分為兩大逡逑類別：溶纖維素和溶細(xì)菌，前者是利用纖維素為底物，后者是利用細(xì)菌作為底物逡逑提供自身生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。粘細(xì)菌所擁有的屬中大部分屬于溶菌類，溶纖維逡逑素類的主要為堆囊菌屬，堆囊菌主要包括纖維堆囊菌和逡逑緊實(shí)堆囊菌�。В鳎恚悖鳎睿穑铮螅瘉樱﹥纱箢悾郏保罚剑福�。逡逑Ｎａｎｎｏｃｙｓｔｉｓ邋１８，８％逡逑Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ邋２３．２％逡逑／邐Ｉ邋ｖ逡逑Ｐｏｌｙａｎｇｉｕｍ邋１．９％邋／邐ｃ邋／．邐＼逡逑Ｃｈｏｎｄｒｏｍｙｃｅｓ邐如吵丨咖邐＼逡逑ｆ＾ｓＬ－４逡逑／邋＊邋ｏｔｈｅｒｓ邋４邋４％逡逑Ｃｏｒａｌｏｃｏｃｃｕｓ邋２３，１％＼邋Ｃｙ＾ｂａｃｔ？Ｗ＾Ｖ＇＇－－邋ｓｔｉｇｍａｔｅｌｉａ邋２，０％逡逑／邐；邋＼邐７邋Ａｒｃｈａｎｇｉｕｍ邋４ｒ６％逡逑Ｃｙｓｔｏｂａｃｔｅｒ５，４％逡逑Ｉ逡逑Ｐ＾ｔ／ｘｏｃｏｃｃｕｓ邋１５，５％逡逑圖１－２邋ＧＢＦ收集的各種粘細(xì)菌所占的粘細(xì)菌總量的比例結(jié)果［１９］逡逑纖維堆囊菌是粘細(xì)菌中一類能降解纖維素的革蘭氏陰性菌

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本文編號(hào)：2718913