【摘要】：粘細菌是自然界中廣泛存在的具有復雜的多細胞行為的革蘭氏陰性細菌,具有滑動的特點,受多種信號途徑的調控。粘細菌次級代謝產物豐富,具有多樣性與生物活性,很多次級代謝產物擁有很大的應用價值,其在藥物開發(fā)中的吸引力僅次于放線菌。但是由于其具有聚團生長、代時長的特點,且培養(yǎng)及遺傳操作困難,因此其基因功能和天然化合物生產能力得不到有效開發(fā),這嚴重影響了粘細菌的研究進展。纖維堆囊菌是一類能降解纖維素的粘細菌,其次級代謝產物埃博霉素是一類具有抗腫瘤活性的聚酮類的大環(huán)內酯類化合物。埃博霉素具有促進微管聚合、抑制其解聚的活性,對腫瘤細胞的作用機制與抗癌藥物紫杉醇的相似,但相比于紫杉醇,埃博霉素具有水溶性好,細胞毒性更小的優(yōu)點,這引起了廣大研究者對埃博霉素的關注與研究。目前,國外已將埃博霉素的衍生物應用到臨床,但由于埃博霉素的生產技術不成熟,產量低,導致埃博霉素的應用和開發(fā)受到限制。引起這一現(xiàn)象主要原因在于纖維堆囊菌的代時長、培養(yǎng)及遺傳操作困難、細胞產量低,因此本實驗室主要從埃博霉素基因簇的遺傳操作和埃博霉素的發(fā)酵優(yōu)化兩方面解決這一問題。近些年,油酯類物質被廣泛應用到生物發(fā)酵的過程中,其中包括一些抗生素的生物發(fā)酵。已經(jīng)報道的可添加植物源油酯進行發(fā)酵的抗生素主要有:紅霉素、泰樂菌素、多殺菌素、頭孢菌素C以及其他的抗生素,且它們的產量均得到不同程度提高。本課題研究了油酯類物質對埃博霉素產量的影響并初步探索其影響機制,本課題所使用的發(fā)酵菌株均是由本實驗室通過對埃博霉素基因簇的遺傳操作獲得的高產突變菌株。本研究的工作主要包括三部分:一、探究油酯類物質對突變菌株發(fā)酵埃博霉素能力的影響根據(jù)前期對埃博霉素基礎發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化,最終確定培養(yǎng)基組分為:酪蛋白胨 1%,酵母浸提粉 0.5%,MgSO4·7H2O0.1%,MOPS10mM,吸附樹脂 2%(v/v),pH7.5。對突變菌株進行發(fā)酵培養(yǎng),30℃,200rpm培養(yǎng)8d檢測出埃博霉素的產量在1.5 mg/L左右。在已優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上添加油酸甲酯和油酯類物質均能提高埃博霉素的產量,其產量提高到10 mg/L左右。油酯類物質的添加解決了埃博霉素產量低且不易被檢測的問題。二、油酯類物質的不同添加方式對突變菌株發(fā)酵埃博霉素的影響將油酯類物質混合添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中,埃博霉素的產量提高,其中混合添加油酸甲酯和菜籽油的提高效果最好,埃博霉素產量提高到15 mg/L。若分批添加發(fā)酵所需最佳的油量,發(fā)現(xiàn)分批添加油酯類物質并沒有進一步提高埃博霉素產量。在Oh添加油酯類物質,發(fā)酵一段時間后補加油酯類物質,發(fā)現(xiàn)補加少量的油酯類物質能進一步提高埃博霉素的產量,使埃博霉素產量高于15 mg/L。若分批補料添加不同濃度油酯類物質,花生油的作用效果優(yōu)于其他的油酯類物質,花生油以0.2%的濃度分批添加時埃博霉素的產量最高,可達18 mg/L。在分批補料添加不同濃度油酯類物質的同時添加適量的丙酸鈉和微量元素均能提高埃博霉素的產量。三、初步探索油酯類物質提高埃博霉素產量的機制通過檢測添加油酯類物質發(fā)酵過程中菌體濃度的變化、埃博霉素產量的變化、埃博霉素基因簇轉錄水平和菌體脂肪酶含量的變化,初步探索油酯類物質在發(fā)酵過程中的影響機制。研究發(fā)現(xiàn),油酯類物質的添加提高了發(fā)酵液的菌體濃度,促進了菌體的生長,延長了菌體穩(wěn)定期。RT-qPCR結果顯示,油酯類物質的添加促進了埃博霉素基因簇轉錄水平的提高,且各個模塊基因的轉錄量均提高顯著。利用ELISA雙抗夾心法,檢測到油酯類物質發(fā)酵過程中脂肪酶含量的變化情況,根據(jù)檢測結果可以得知添加油酯類物質提高了脂肪酶的含量,為后續(xù)研究油酯類物質的作用機制提供了參考。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：TQ920.6
【圖文】：

其營養(yǎng)細胞呈桿狀，長度在３－６｜ｉｍ之間，寬度為０．７－１．０叫１［３］。粘細菌能在固逡逑體表面滑動，并且具有復雜的多細胞行為。當在饑餓的環(huán)境下無法獲得充足的營逡逑養(yǎng)物質時粘細菌會形成特異的子實體（圖１－１）。這些子實體能夠形成接近１０５逡逑個個體，并且不同種屬間的個體從它們的長度，形狀和顏色上表現(xiàn)出廣泛的差異逡逑性［５］。逡逑圖１－１邋ａ圖表示粘細菌的子實體；ｂ圖是粘細菌在酪蛋白胨平板上的形態(tài)［６］逡逑粘細菌是種好氧異養(yǎng)型菌，在其的研究初期人們認為粘細菌不能在液體環(huán)境逡逑中培養(yǎng)，后被證明此觀點是錯誤的。雖然粘細菌在環(huán)境中普遍存在，并且在一些逡逑極端環(huán)境下也能生長，但是只有在營養(yǎng)豐富的條件下，粘細菌才呈現(xiàn)出良好的生逡逑長狀態(tài)。實驗室中常用蛋白胨、酵母粉、大豆粉等營養(yǎng)成分較豐富的營養(yǎng)物質充逡逑當粘細菌的營養(yǎng)原料。經(jīng)研宄發(fā)現(xiàn)，粘細菌的最佳發(fā)酵溫度為２８°Ｃ－３０°Ｃ，ｐＨ為逡逑７．０－８．０之間晸。在粘細菌的培養(yǎng)過程中存在聚團生長、菌落生長緩慢、不能形逡逑１逡逑

要包括：肽類、大環(huán)、芳香族等。逡逑由德國國家生物技術研宄中心（ＧＢＦ）對粘細菌收集的結果顯示，粘細菌種逡逑類繁多，大約分離出７０００株（圖１－２），根據(jù)利用的底物不同主要可以分為兩大逡逑類別：溶纖維素和溶細菌，前者是利用纖維素為底物，后者是利用細菌作為底物逡逑提供自身生長所需的營養(yǎng)物質。粘細菌所擁有的屬中大部分屬于溶菌類，溶纖維逡逑素類的主要為堆囊菌屬，堆囊菌主要包括纖維堆囊菌和逡逑緊實堆囊菌�。В鳎恚悖鳎睿穑铮螅瘉樱﹥纱箢悾郏保罚剑福荨ｅ义希危幔睿睿铮悖螅簦椋箦澹保�，８％逡逑Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ邋２３．２％逡逑／邐Ｉ邋ｖ逡逑Ｐｏｌｙａｎｇｉｕｍ邋１．９％邋／邐ｃ邋／．邐＼逡逑Ｃｈｏｎｄｒｏｍｙｃｅｓ邐如吵丨咖邐＼逡逑ｆ＾ｓＬ－４逡逑／邋＊邋ｏｔｈｅｒｓ邋４邋４％逡逑Ｃｏｒａｌｏｃｏｃｃｕｓ邋２３，１％＼邋Ｃｙ＾ｂａｃｔ？Ｗ＾Ｖ＇＇－－邋ｓｔｉｇｍａｔｅｌｉａ邋２，０％逡逑／邐；邋＼邐７邋Ａｒｃｈａｎｇｉｕｍ邋４ｒ６％逡逑Ｃｙｓｔｏｂａｃｔｅｒ５，４％逡逑Ｉ逡逑Ｐ＾ｔ／ｘｏｃｏｃｃｕｓ邋１５，５％逡逑圖１－２邋ＧＢＦ收集的各種粘細菌所占的粘細菌總量的比例結果［１９］逡逑纖維堆囊菌是粘細菌中一類能降解纖維素的革蘭氏陰性菌

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本文編號：2718913