【摘要】：吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone,PQQ)是一種醌蛋白脫氫酶的輔酶,在微生物、動物和植物體中展現(xiàn)出多樣的生物活性,廣泛應(yīng)用于保健品、化妝品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和環(huán)境等領(lǐng)域。由于化學(xué)合成法成本畸高,微生物發(fā)酵法生產(chǎn)PQQ受到廣泛關(guān)注。因此,本研究以扭脫甲基桿菌(Methylobacterium extorquens)I-F2為研究對象,提出一種整合流式細(xì)胞術(shù)分選和高通量篩選的策略,高效地篩選出PQQ高產(chǎn)突變菌株。此外,對菌株培養(yǎng)條件和發(fā)酵過程進(jìn)行優(yōu)化,確定了最佳培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件,進(jìn)一步強化扭脫甲基桿菌合成PQQ的能力。本文主要研究結(jié)果具體如下:(1)以M.extorquens I-F2為出發(fā)菌株,通過整合常壓室溫等離子體(Atmospheric and room temperature plasma,ARTP)誘變、流式細(xì)胞術(shù)分選和高通量篩選策略,提高了誘變篩選效率。通過優(yōu)化樣品制備處理過程和調(diào)校流式分選參數(shù),進(jìn)一步提高分選準(zhǔn)確性。確定樣品染色條件:10?g·mL~(-1)的PI與樣品以1:1的比例混合后避光20°C下染色30 min。通過4輪逐級ARTP誘變處理,篩選獲得了一株P(guān)QQ高產(chǎn)突變菌株M.extorquens 1-C6,經(jīng)傳代實驗檢測,其具有遺傳穩(wěn)定性。對篩選獲得的菌株M.extorquens 1-C6進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,其產(chǎn)量為16.0 mg·L~(-1),較出發(fā)菌株提高了1.5倍。(2)在搖瓶上研究了甲醇、氮源、金屬離子和生長因子對突變菌株產(chǎn)PQQ的影響。經(jīng)單因素實驗優(yōu)化確定了種子培養(yǎng)基中金屬離子和生長因子最適添加濃度為:CoCl_2·6H_2O 20 mg·L~(-1),檸檬酸鐵8 mg·L~(-1),ZnSO_4·7H_2O 4 mg·L~(-1),CuSO_4·5H_2O 0.5mg·L~(-1),核黃素4μg·L~(-1),吡哆醇4μg·L~(-1),鈷胺素2μg·L~(-1),對氨基苯甲酸15μg·L~(-1),泛酸鈣30μg·L~(-1),硫辛酸10μg·L~(-1)。在此基礎(chǔ)上,通過Plackett-Burman設(shè)計和響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基,確定甲醇、硫酸銨、硫辛酸和核黃素對產(chǎn)PQQ有顯著影響,其最適添加濃度為:甲醇30 mL·L~(-1),硫酸銨1.75 g·L~(-1),硫辛酸8μg·L~(-1),核黃素2.5μg·L~(-1)。優(yōu)化后菌株M.extorquens 1-C6經(jīng)搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量為29.1 mg·L~(-1),較初始條件提高了81.9%。(3)在3 L發(fā)酵罐上研究了甲醇初始濃度、pH和補料方式對突變菌株產(chǎn)PQQ的影響。通過控制分批發(fā)酵過程中不同甲醇初始濃度,確定分批發(fā)酵最適甲醇初始濃度為40mL·L~(-1)。通過控制分批發(fā)酵過程中不同pH,確定分批發(fā)酵的pH控制策略:控制初始pH值為7.0,自然下降至6.0后恒定控制在該水平。對分批發(fā)酵過程中補料方式及補料濃度進(jìn)行研究,確定了甲醇濃度自然降低至20 m L·L~(-1)時控制其濃度恒定在該水平的補料分批發(fā)酵策略。經(jīng)優(yōu)化后菌株M.extorquens 1-C6在3 L發(fā)酵罐上產(chǎn)量為208.7 mg·L~(-1),是分批發(fā)酵的5.9倍。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：TQ925
【圖文】：

第一章 緒論第一章 緒論背景uinoline quinone，PQQ，也稱 Methoxatin酶(ADH 和 GDH)的輔因子的水溶性醌化微生物、植物和動物組織中，在細(xì)胞內(nèi)以 作為輔因子參與呼吸鏈電子傳遞，在氧化還原型是 PQQH2，在氧氣存在下迅速自PQQ 有更強的抗氧化活性[2]。

圖 1-2 PQQ 的骨架結(jié)構(gòu)Fig. 1-2 The backbone structure of PQQ發(fā)酵法研究進(jìn)展物發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn) PQQ 存在缺少優(yōu)良菌株的問題，生物發(fā)酵法重要研究方向之一。在 1983 年，Ameyama的甲基營養(yǎng)菌最有利于 PQQ 生產(chǎn)，該菌株發(fā)酵 2 d 在培mg·L-1。隨后 Mcintire 和 Weyler[42]第一次報道了甲基營

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本文編號：2715354