【摘要】：竹黃菌(Shiraia bambusicola)是中國(guó)常見(jiàn)的一種藥用真菌,民間常用其來(lái)治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、坐骨神經(jīng)痛、腰肌勞損、跌打損傷和虛寒胃痛等疾病。作為竹黃菌的主要活性成分,竹紅菌素是一種優(yōu)良的光敏劑,其在特定的光照條件下能夠產(chǎn)生活性氧(ROS)。ROS會(huì)損傷生物大分子并導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。竹紅菌素在抗菌,抗病毒和抗腫瘤等方面展現(xiàn)出良好的藥理活性,在食品,飼料,環(huán)保和醫(yī)療等領(lǐng)域有著巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。但目前商業(yè)應(yīng)用和科研使用均是基于天然得到的竹紅菌素,無(wú)法解決量產(chǎn)的問(wèn)題。天然竹黃具有地域局限性、生長(zhǎng)季節(jié)短暫和產(chǎn)量低等缺陷,因此通過(guò)生物發(fā)酵法來(lái)獲得竹紅菌素成為主要趨勢(shì)。而與液態(tài)發(fā)酵(LSF)相比,固態(tài)發(fā)酵(SSF)具有能量消耗低,生產(chǎn)成本低,無(wú)廢水排放,體積生產(chǎn)率高且不易染雜菌,一些應(yīng)用無(wú)需提取純化便可直接使用等優(yōu)勢(shì),所以SSF生產(chǎn)竹紅菌素成為本研究的重點(diǎn)。本課題組前期已經(jīng)篩選獲得一株高產(chǎn)竹紅菌素的竹黃菌Shiraia sp.SUPER-H168,并對(duì)竹黃菌的發(fā)酵基質(zhì)和培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究。本論文對(duì)竹黃菌進(jìn)行了以下研究:光照對(duì)竹黃菌生長(zhǎng)、繁殖及色素產(chǎn)生的影響;竹黃菌SSF時(shí)的生長(zhǎng)分析;對(duì)竹黃菌的SSF培養(yǎng)(種子液類型,攪拌和外源添加淀粉酶)進(jìn)行了優(yōu)化;竹黃菌SSF培養(yǎng)時(shí)淀粉酶的分離純化;竹黃菌內(nèi)淀粉酶的預(yù)測(cè)與分析;過(guò)表達(dá)淀粉酶對(duì)竹黃菌的影響;過(guò)表達(dá)血紅蛋白對(duì)竹黃菌的影響。主要研究結(jié)果如下:(1)光照對(duì)竹黃菌的影響。暗培養(yǎng)時(shí)色素的產(chǎn)量最高,為每平板13.73 mg;藍(lán)光下培養(yǎng)時(shí)色素的產(chǎn)量最低,為每平板2.83 mg。與暗培養(yǎng)相比,所有的光照培養(yǎng)都促進(jìn)了氣生菌絲的生長(zhǎng),但降低了色素的產(chǎn)量。氣生菌絲在藍(lán)光培養(yǎng)時(shí)的生成量最多。光照促進(jìn)了竹黃菌的有性繁殖但抑制無(wú)性繁殖,尤其是藍(lán)光培養(yǎng)時(shí)強(qiáng)烈抑制無(wú)性繁殖。暗培養(yǎng)時(shí)竹黃菌僅進(jìn)行無(wú)性繁殖,并且無(wú)性孢子產(chǎn)生的最多。有性孢子呈短棒狀,無(wú)性孢子呈球狀。使用光學(xué)顯微鏡和SEM觀察到竹黃菌的四種菌絲:表面菌絲,氣生菌絲,生物膜層菌絲和基質(zhì)菌絲。發(fā)現(xiàn)竹紅菌素僅在生物膜層菌絲進(jìn)行合成分泌,暗培養(yǎng)時(shí)生物膜層菌絲的厚度為300μm左右。(2)竹黃菌SSF產(chǎn)竹紅菌素的優(yōu)化。以真菌種子培養(yǎng)液接種時(shí),竹黃菌SSF的周期為15 d;初始攪拌在發(fā)酵第3 d進(jìn)行;此后的攪拌間隔時(shí)間為36 h;外源添加淀粉酶以細(xì)菌中溫α-淀粉酶和糖化酶的復(fù)合添加為最佳,其中細(xì)菌中溫α-淀粉酶在固態(tài)發(fā)酵初始階段加入,添加量為2.85 U?gds~(-1),糖化酶在發(fā)酵第3 d加入,添加量為29.78 U?gds~(-1)。經(jīng)過(guò)攪拌和外加淀粉酶的研究后,色素產(chǎn)量在發(fā)酵13 d后達(dá)到60.74 mg?gds~(-1),固態(tài)發(fā)酵物中淀粉的殘留量為27.42%。(3)對(duì)竹黃菌SSF的淀粉酶進(jìn)行了分離純化,經(jīng)過(guò)冷乙醇沉淀,陰離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析三步純化后得到一電泳純的α-葡萄糖苷酶AMY33,分子量為108.2 kDa,最適反應(yīng)溫度為60℃,最適pH為4.5。以α-pNPG為底物時(shí),AMY33的K_m,V_(max)和k_(cat)/K_m分別為0.52 mmol·L~(-1),3.76 U·mg~(-1)和1.3×10~4 L·s~(-1)·mol~(-1)。而當(dāng)以淀粉和麥芽糖為底物時(shí),α-葡萄糖苷酶的K_m分別為2.38 mg·mL~(-1)和0.62 mmol·L~(-1)。AMY33對(duì)麥芽糖和蔗糖具有轉(zhuǎn)糖基活性,而對(duì)海藻糖沒(méi)有轉(zhuǎn)糖基活性。同時(shí),AMY33能夠水解蔗糖的α-1,2-糖苷鍵,并且對(duì)海藻糖的α-1,1-糖苷鍵也有微弱的活性。AMY33的基因序列中有長(zhǎng)度為2997 bp的閱讀框,編碼998個(gè)氨基酸,其中有22個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽;序列中含有一個(gè)長(zhǎng)度為48 bp的內(nèi)含子。AMY33的等電點(diǎn)大約是5.08。對(duì)竹黃菌Shiraia sp.SUPER-H168的淀粉酶進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析�？偣泊嬖�24個(gè)淀粉酶,其中有10個(gè)是α-葡萄糖苷酶,3個(gè)葡糖淀粉酶,8個(gè)α-淀粉酶,3個(gè)支鏈淀粉酶。(4)以不同碳源(葡萄糖,蔗糖,麥芽糖,直鏈淀粉,支鏈淀粉酶和玉米粉)對(duì)竹黃菌進(jìn)行培養(yǎng),對(duì)24種淀粉酶的表達(dá)水平進(jìn)行分析。在以麥芽糖,直鏈淀粉和支鏈淀粉為碳源進(jìn)行培養(yǎng)時(shí),amy33,amy365-1和amy130的表達(dá)水平分別最高。對(duì)淀粉酶進(jìn)行過(guò)表達(dá)研究,構(gòu)建了五株過(guò)表達(dá)菌株。LSF培養(yǎng)時(shí),與野生菌相比較,五株過(guò)表達(dá)菌株的生物量和色素的產(chǎn)量隨發(fā)酵時(shí)間逐漸增加,而殘?zhí)橇恐饾u降低。SSF培養(yǎng)時(shí),在amy365-1和amy130共表達(dá)的菌株,色素的產(chǎn)量在第13 d達(dá)到最高產(chǎn)量71.85 mg·gds~(-1),是野生菌色素產(chǎn)量(25.37 mg·gds~(-1))的2.83倍。當(dāng)amyAF,amy365-1或者amy130進(jìn)行過(guò)表達(dá)時(shí),amy33的相對(duì)表達(dá)水平得到了增加。經(jīng)過(guò)15 d的發(fā)酵后,amy365-1和amy130共表達(dá)菌株發(fā)酵基質(zhì)中淀粉的殘留量為19.56%。(5)對(duì)血紅蛋白基因vgb進(jìn)行了過(guò)表達(dá)研究,構(gòu)建了兩株過(guò)表達(dá)菌株。LSF培養(yǎng)時(shí),當(dāng)amy365-1和vgb共表達(dá)時(shí),色素在96 h時(shí)到達(dá)了最高產(chǎn)量3681 mg?L~(-1),是野生菌色素產(chǎn)量(703 mg?L~(-1))的5.24倍;SSF培養(yǎng)時(shí),在amy365-1和vgb共表達(dá)時(shí),色素達(dá)到了本研究的最高產(chǎn)量75.89 mg·gds~(-1)。在vgb進(jìn)行過(guò)表達(dá)時(shí),amy365-1的相對(duì)表達(dá)水平得到了提升,同時(shí)提高了SSF時(shí)淀粉酶的活力;此外,SSF的周期由13 d縮短到11 d。經(jīng)過(guò)15 d的發(fā)酵后,amy365-1和vgb共表達(dá)菌株發(fā)酵基質(zhì)中淀粉的殘留量為16.87%。
【圖文】：

圖 1-1 竹黃子座中主要生物活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1-1 Chemical structures of biological active components in the stromata of S. bambusicola（2）竹黃菌多糖真菌多糖是藥用真菌具有生物活性的主要有效組分，其在生物體內(nèi)不僅提供能量與結(jié)構(gòu)組成，更具有多種生物學(xué)功能。方積年等[7]將竹黃子實(shí)體經(jīng)分離后按常規(guī)發(fā)酵分離，純化得到竹黃多糖 SB1 和 SB2 兩個(gè)組分，SB1 包含 D-葡萄糖、D-半乳糖和拉伯糖，摩爾比為 0.37：1.00：0.07；SB2 包含 D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖和拉伯糖，，摩爾比為 0.25：1.00：0.47：0.12。蔡宇杰等從竹黃菌 Shiraia sp. SUPER-H1

12 位則取代基多樣，由此構(gòu)成多種化合物或化合物的不同類型。傒醌類色素母環(huán)及其幾種主要衍生物見(jiàn)圖1-2。傒醌類化合物是一類能夠產(chǎn)生活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的光敏性物質(zhì)，如同其在自然界中的許多重要功能，其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。例如，卡弗他丁 C（calphostin C）是作用于蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）調(diào)節(jié)區(qū)的特異性抑制劑[18]，同時(shí)也被用于癌癥治療的研究[19-21]。竹紅菌素及其衍生物在中國(guó)已經(jīng)應(yīng)用于臨床，同時(shí)被廣泛用于光動(dòng)力學(xué)療法（Photodynamic therapy，PDT）來(lái)進(jìn)行腫瘤治療和抗病毒的研究[22-25]。其中，ROS 被廣泛定義為含有氧原子的化學(xué)活性分子
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：TQ920.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2701454