【摘要】：解脂耶氏酵母(Yarrowialipolyticaa)是一種非常規(guī)的產(chǎn)油酵母,由于其充足的前體供應,適于生產(chǎn)各種源于乙酰輔酶A的下游化合物。但以葡萄糖為碳源時,產(chǎn)生乙酰輔酶A的同時會伴隨二氧化碳(CO2)的釋放,造成碳損失及得率的降低。而以脂肪酸作為底物時,脂肪酸轉(zhuǎn)化成�；o酶A后進入過氧化物酶體,經(jīng)過β-氧化產(chǎn)生乙酰輔酶A,這一過程不產(chǎn)生C02,不存在碳源的損失,具有更高的碳轉(zhuǎn)化率。近年來越來越多的研究表明,特定酶或者代謝途徑的亞細胞定位不僅有助于提高產(chǎn)物轉(zhuǎn)化效率,而且能夠起到消除競爭性代謝抑制的作用。因此,本論文將甲羥戊酸途徑過表達并定位至解脂耶氏酵母過氧化物酶體,構(gòu)建α-法呢烯合成工程菌,以脂肪酸或油脂為碳源,高效合成乙酰輔酶A下游產(chǎn)物,重要萜類化合物α-法呢烯。首先,本研究測試了文獻報道的在釀酒酵母使用的增強型過氧化物酶體定位信號(ePTS1),可以高效地在解脂耶氏酵母中將目的蛋白定位至過氧化物酶體。在此基礎上,使用該定位信號(ePTS1)將甲羥戊酸合成途徑的三個基因AtoB、HMGS、HMGR定位至過氧化物酶體,得到能夠利用脂肪酸高效生產(chǎn)甲羥戊酸的工程菌株MP2。通過搖瓶發(fā)酵分析,解脂耶氏酵母工程菌株MP2可以產(chǎn)生約2.725 g/L甲羥戊酸,得率達到0.072 g/g底物,而胞質(zhì)超表達甲羥戊酸途徑的對照工程菌株M1的甲羥戊酸產(chǎn)量雖然相當,但得率僅為0.031 g/g底物。該研究結(jié)果表明,甲羥戊酸合成途徑基因的過氧化物酶體定位,能夠使解脂耶氏酵母利用脂肪酸生產(chǎn)甲羥戊酸,其得率比在胞質(zhì)中利用葡萄糖生產(chǎn)甲羥戊酸的得率更高。解脂耶氏酵母胞質(zhì)中自身存在MVA途徑,適合萜類化合物的合成。倍半萜α-法呢烯是一種有潛力的生物燃料,具有重要的應用價值。在高產(chǎn)甲羥戊酸菌株MP2的基礎上,超表達α-法呢烯合成酶FS,使解脂耶氏酵母可以利用油酸合成72 mg/L α-法呢烯。在胞質(zhì)中逐步過表達從甲羥戊酸到α-法呢烯合成途徑的關鍵酶,α-法呢烯的產(chǎn)量逐步增高。在胞質(zhì)過表達α-法呢烯合成途徑全部酶的工程菌株F4,利用油酸發(fā)酵120 h,α-法呢烯的產(chǎn)量達到0.365 g/L。與此同時,逐步將從甲羥戊酸至α-法呢烯合成途徑的酶過表達并定位至過氧化物酶體,α-法呢烯產(chǎn)量逐步增高。全部酶在過氧化物酶體定位表達的工程菌株FP3利用YPO培養(yǎng)基發(fā)酵120 h,α-法呢烯產(chǎn)量達到0.391 g/L,比工程菌株F4生產(chǎn)α-法呢烯的產(chǎn)量略高,說明α-法呢烯代謝途徑定位至過氧化物酶體可以避免胞質(zhì)環(huán)境的代謝競爭,有利于α-法呢烯的專一性合成,提高了 α-法呢烯的產(chǎn)量,但是由于甲羥戊酸可以自由通過過氧化物酶體膜,較多的法呢烯代謝途徑基因可能對蛋白質(zhì)的定位效率造成負面影響,導致工程菌株FP3的α-法呢烯產(chǎn)量與F4相差不多。本研究還探究了解脂耶氏酵母FP3利用不同種類油脂生產(chǎn)α-法呢烯的情況。結(jié)果表明,工程菌株FP3可以高效利用不同種類油脂生產(chǎn)α-法呢烯,與利用油酸作為碳源相比,三油酸甘油酯更有利于工程菌株FP3生產(chǎn)α-法呢烯。在發(fā)酵罐中進行補料分批發(fā)酵,工程菌株FP3利用三油酸甘油酯并控制pH為6.0進行發(fā)酵168 h,α-法呢烯產(chǎn)量達到1.66 g/L,得率達到0.025 g/g底物。
【圖文】：

圖１－１邋ａ－法呢烯結(jié)構(gòu)式逡逑隆并分離鑒定了一種來源于Ａｎｇｌｏｎｇ邋Ｗａｎｇ等對大腸桿菌進量達到３８０邋ｍｇ／Ｌ［８６］，而另一。ＳｔｅｆａｎＴｉｐｐｍａｎｎ等利用釀耶氏酵母適合ａ－法呢烯的生量和得率都比較低，僅為２６０往往利用葡萄糖進行包括ａ－為碳源時，丙酮酸脫羧形成萜類化合物合成的得率降低，與意義逡逑

２．３．２甲羥戊酸合成途徑基因的克隆表達逡逑解脂耶氏酵母表達載體分為兩種，即游離型質(zhì)粒和整合型質(zhì)粒。游離型表達逡逑載體可以在解脂耶氏酵母細胞里進行復制而游離存在，常見的游離型質(zhì)粒有逡逑ＹＬＥＰ，根據(jù)其篩選標記分為ＹＬＥＰ－Ｌｅｕ和ＹＬＥＰ－Ｕｒａ，需要在相應的營養(yǎng)缺陷型逡逑培養(yǎng)基中ＳＤ－Ｌｅｕ和ＳＤ－Ｕｒａ中培養(yǎng)才能使其穩(wěn)定存在。而酵母整合型質(zhì)粒需要逡逑整合到酵母染色體上，才能隨著染色體的復制而穩(wěn)定存在。常見的解脂耶氏酵母逡逑整合型質(zhì)粒有ｐＩＮＡ１３１２、ＪＭＰ１１３和ＪＭＰ１１４，以及由它們衍生而來的一系列質(zhì)逡逑粒。酵母基因整合方法主要分為同源重組（ＨＲ）和不依賴同源臂的基因組整合逡逑方式［２２］。釀酒酵母中同源重組的效率較高，，然而，與釀酒酵母不同，解脂耶氏逡逑酵母中同源重組的效率很低，ＤＮＡ雙鏈斷裂（ＤＳＢ）修復的主要方式是通過非逡逑同源末端連接（ＮＨＥＪ）的方式進行。先前工作中，本課題組在解脂耶氏酵母中逡逑建立了一種不依賴同源臂的基因組整合方法，該方法具有易操作、高保真性、易逡逑
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TQ920.6;O629.61

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