【摘要】：本研究以β-胡蘿卜素產(chǎn)業(yè)化為目標(biāo),采用低能離子束對(duì)三孢布拉氏霉進(jìn)行注入誘變,結(jié)合平板顯色反應(yīng)進(jìn)行高通量篩選,獲得高產(chǎn)菌株,同時(shí)完成了對(duì)β-胡蘿卜素高效液相色譜檢測(cè)方法的研究,在此基礎(chǔ)上,對(duì)高產(chǎn)菌株發(fā)酵工藝進(jìn)行深入研究。在采用代謝組學(xué)研究基礎(chǔ)上,開發(fā)了在線監(jiān)控技術(shù)并進(jìn)行了 12 m3發(fā)酵罐的發(fā)酵放大生產(chǎn)。隨后完成了β-胡蘿卜素高效提取及粉劑制備技術(shù)的研究,獲得了高品質(zhì)的產(chǎn)品:β-胡蘿卜素干菌體、油懸液、晶體及粉劑產(chǎn)品,最終完成了β-胡蘿卜素的產(chǎn)業(yè)化。首先,對(duì)三孢布拉氏霉菌種進(jìn)行低能離子束注入誘變及高效篩選,得到高產(chǎn)菌株,研究了不同通氣量及碳源流加控制策略對(duì)該菌株的β-胡蘿卜素合成的影響。發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過程中提高通氣量并限制性流加葡萄糖,β-胡蘿卜素產(chǎn)量從2.28 g/L提高至3.2 g/L,干菌體中β-胡蘿卜素含量(β-carotene/Dry cell weight,BC/DCW)從61.7提高至78.1 mg/g DCW,分別提高了40.4%、26.6%。本文還創(chuàng)造性將正菌和負(fù)菌(兩種不同生理性狀的菌株,需要接合后才能刺激菌種生產(chǎn)β-胡蘿卜素)種子液用均質(zhì)機(jī)預(yù)處理后接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中生產(chǎn)β-胡蘿卜素。結(jié)果表明,β-胡蘿卜素產(chǎn)量和BC/DCW分別比對(duì)照提高了 29.9%和24.1%。代謝組學(xué)研究表明,經(jīng)均質(zhì)機(jī)處理后的糖酵解途徑(磷酸和甘油)和脂肪酸(油酸和亞油酸)相關(guān)代謝物與對(duì)照明顯不同。對(duì)葵花籽油和檸檬酸的添加進(jìn)行了優(yōu)化,β-胡蘿卜素產(chǎn)量和BC/DCW分別比對(duì)照提高了40.23%和6.8%。在12m3發(fā)酵罐上采用在線均質(zhì)機(jī)對(duì)種子液進(jìn)行預(yù)處理并結(jié)合混合油和檸檬酸策略性流加方式,β-胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)到4.48 g/L,此外還嘗試了磷酸化二淀粉磷酸酯添加及植酸調(diào)控βH,結(jié)合半連續(xù)培養(yǎng)的方式,可將β-胡蘿卜素的產(chǎn)量進(jìn)一步提升至4.8 g/L,是三孢布拉氏霉研究工藝中報(bào)道的最高產(chǎn)量。在高效提取方面,嘗試各種不同的提取方式,結(jié)果發(fā)現(xiàn):采用復(fù)合酶法對(duì)發(fā)酵菌體進(jìn)行預(yù)處理,隨后進(jìn)行干燥造粒、溶劑萃取,相比常規(guī)萃取,β-胡蘿卜素提取收率提高了 28.8%。在熱溶劑萃取段,使用抗氧化劑可以減少β-胡蘿卜素的氧化,進(jìn)一步提高12%的萃取率;結(jié)晶工藝采低溫結(jié)晶法,相比蒸發(fā)結(jié)晶更加節(jié)能,也減少了晶體長(zhǎng)時(shí)間受熱的損失量,綜合收率可以達(dá)到80%以上。在產(chǎn)品研究方面,本研究采用噴霧干燥、噴霧冷凍干燥、包衣及噴霧造粒四種工藝對(duì)β-胡蘿卜素進(jìn)行包埋。掃描電鏡結(jié)果顯示包衣工藝最為致密。通過對(duì)β-胡蘿卜素微膠囊進(jìn)行6個(gè)月的穩(wěn)定性測(cè)試發(fā)現(xiàn),包衣工藝可以最大程度的保留β-胡蘿卜素的含量,是最合適的包埋工藝。
【圖文】：

２．４．１．１邋Ｐ－胡蘿卜素含量檢測(cè)條件優(yōu)化逡逑分別以乙酸乙酯－乙腈－水和四氫呋喃－水為流動(dòng)相體系，比較在不同流動(dòng)相逡逑中胡蘿卜素的響應(yīng)值以及色譜峰的分離情況。由圖２－１與２－２可知乙酸乙酯－乙逡逑腈－水為流動(dòng)相時(shí)胡蘿卜素的響應(yīng)值較高，在１３．１１２邋ｍｉｎ左右出現(xiàn)的峰為胡逡逑蘿卜素的色譜峰，，能很好地和溶劑峰、雜質(zhì)峰分離，故選用乙酸乙酯－乙腈－水逡逑為流動(dòng)相。逡逑＾４５０逡逑３６０逡逑２７０逡逑Ｉ１８０邐Ｉ逡逑９0邋－邋ＡＩ逡逑０邐１邐ｆ邋邐１邐１邐！逡逑１０邐１５邐２０邐２５逡逑－９０邐時(shí)間（ｍｉｎ）逡逑圖２＿１邐０－胡蘿卜素晶體液相色譜圖（四氫呋喃－水）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１邋Ｌｉｑｕｉｄ邋ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐ

于細(xì)胞破碎。本實(shí)驗(yàn)考察了以下３種方法的的提取效果：①菌體粉碎后直接提逡逑��；②菌體粉碎后使用研抌破壁；③菌體粉碎后使用勻漿器破壁；３種不同提逡逑取方法所得到的乙酸乙酯萃取液中Ｐ－胡蘿卜素含量結(jié)果見圖２－３。逡逑１７逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TQ920.6

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本文編號(hào)：2685494