【摘要】：長鏈二元酸(Long chain dicarboxylic acid)是一類用途極其廣泛的脂肪族二羧酸。熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)是可以通過發(fā)酵脂肪酸和烷烴來生產長鏈二元酸(DCA)的高產微生物。本研究以能夠催化油脂生產長鏈二元酸的C.tropicalis 1798為研究對象,利用大腸桿菌中的mazF基因作為反向篩選標記構建了自殺載體pPICPJm,以促進熱帶假絲酵母甘油利用的基因gk、調控脂肪酸β-氧化過程的基因CRAT以及ω-氧化過程中的關鍵酶P450為目標,在通過分子生物學技術構建的基因無痕編輯系統(tǒng)基礎上對gk基因和細胞色素P450酶、NADH-細胞色素P450還原酶的啟動子基因進行替換,對肉毒堿乙酰轉移酶基因CRAT作單拷貝敲除。論文的主要結果如下:(1)獲取來源于大腸桿菌Escherichia coli中的毒素蛋白基因mazF基因,解脂耶氏酵母Candida lipolytica 1457中的啟動子基因pGAL,通過重疊PCR方法構建重疊片段pGAL-mazF,將其連同抗性標簽Kan~r基因通過無縫克隆手段連接至載體pPICzαA構建成自殺質粒pPICPJm作為熱帶假絲酵母分子改造過程中的基因無痕編輯載體。將自殺質粒pPICPJm電轉化至C.tropicalis并通過抗生素G418抗性及PCR篩選后,分別在含有半乳糖濃度為0 g/L,5 g/L和10 g/L的平板上劃線培養(yǎng),結果顯示10 g/L的半乳糖能夠有效抑制C.tropicalis-pPICPJm的生長,因此后續(xù)以10 g/L的半乳糖篩選發(fā)生第二次單交換的重組子。(2)在自殺質粒pPICPJm的基礎上,將C.tropicalis 1798作為出發(fā)菌株,通過基因重組的手段,構建了工程菌C.tropicalis gkPr,通過抗生素G418抗性及PCR篩選,證實gk基因啟動子替換工程菌C.tropicalis gkPr構建成功。經發(fā)酵驗證顯示,啟動子基因替換菌C.tropicalis gkPr甘油利用率提升了56.1%,表明啟動子替換能促進C.tropicalis 1798對甘油吸收利用,從而為熱帶假絲酵母發(fā)酵供能。以玉米油為底物進行發(fā)酵時還發(fā)現重組菌產十二碳二元酸的量比出發(fā)菌提高32.7%。(3)利用PCR技術擴增得到C.tropicalis的同源臂CRATpF和CRATpR,重疊PCR拼接后,通過無縫克隆技術連接至自殺質粒pPICPJm,在C.tropicalis gkPr基礎上運用電轉化法進行同源片段重組,構建了CRAT基因單拷貝缺失菌C.tropicalis gkPc。通過抗生素G418抗性和PCR實驗的篩選,證實了CRAT基因單拷貝缺失菌C.tropicalis gkPc構建成功。搖瓶實驗表明,單拷貝缺失菌C.tropicalis gkPc十二碳二元酸產量較原始菌株C.tropicalis 1798十二碳二元酸產量升高,產量為7.13 g/L。表明由于CRAT基因的單拷貝敲除,減弱了細胞內脂肪酸的消耗,導致產酸水平的提升。(4)基于以上的研究,以細胞色素P450酶和NADPH-細胞色素P450還原酶為目標,在C.tropicalis gkPc的基礎上,對細胞色素P450和NADPH-細胞色素P450還原酶的啟動子基因進行了替換,構建了啟動子替換工程菌C.tropicalis GCPP。搖瓶發(fā)酵顯示重組菌株C.tropicalis GCPP十二碳二元酸產量為11.39 g/L,是原始菌產量的2.8倍,5 L發(fā)酵罐發(fā)酵顯示C.tropicalis GCPP十二碳二元酸產量達到了35.64 g/L。
【圖文】：

圖 1.1 熱帶假絲酵母代謝烷烴生產二元酸Fig.1.1 Candida tropicalis metabolizes alkanes to produce dibasic acids

圖 1.1 熱帶假絲酵母代謝烷烴生產二元酸Fig.1.1 Candida tropicalis metabolizes alkanes to produce dibasic acids
【學位授予單位】：齊魯工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：TQ921

【參考文獻】

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1 桂秋芬;姚嘉e，

本文編號：2680664