【摘要】：甲殼素是自然界中含量僅次于纖維素的天然多糖,其水解產(chǎn)物N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)在功能食品及生物醫(yī)藥領(lǐng)域已有重要應(yīng)用。傳統(tǒng)的酸制備法容易造成一定的環(huán)境污染,因此,探索生物法制備甲殼素及其衍生物具有重要意義。甲殼素酶是目前已發(fā)現(xiàn)的能在溫和條件下專一性將甲殼素水解為水溶性的甲殼寡糖和N-乙酰氨基葡萄糖的酶,但其在高溫條件下熱穩(wěn)定性不好,同時,甲殼素本身致密的晶體結(jié)構(gòu)阻礙了酶分子與底物分子接觸,難以進行有效催化。因此,從應(yīng)用角度出發(fā),探索一種基于甲殼素酶催化的高效制備N-乙酰氨基葡萄糖的反應(yīng)體系,以取代傳統(tǒng)的化學催化工藝,具有重要的環(huán)保價值和經(jīng)濟價值。從科學角度出發(fā),理性認識甲殼素酶的分子結(jié)構(gòu)與催化功能之間的構(gòu)效關(guān)系,并進一步通過溶劑工程調(diào)控強化酶催化過程,是本研究擬解決的兩個關(guān)鍵問題。本研究的主要成果如下:(1)為了解決甲殼素酶來源的問題,從含蟹殼土壤中篩選得到一株高產(chǎn)甲殼素酶的微生物菌株,經(jīng)細胞形態(tài)、生理生化實驗及分子生物學鑒定,確定該菌株為一種Paenibacillus pasadenensis,并將其命名為Paenibacillus pasadenensis CS0611。通過對培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化,在以蟹殼粉CSP為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長2天后,CSP完全降解,發(fā)酵液中甲殼素酶活力可達798.6±16.6 U/L。(2)為了解決野生菌發(fā)酵發(fā)酵周期長、酶分離純化操作繁瑣等問題,克隆了甲殼素酶基因并將其異源表達于大腸桿菌中。通過基因組測定及分析,Paenibacillus pasadenensis CS0611含有四種甲殼素酶PpChi1、PpChi2、PpChi3和PpChi4,分子量分別為65.4 kDa、45.7 kDa、38.1 kDa和42.4 kDa。構(gòu)建分別含有4種甲殼素酶基因的重組質(zhì)粒,實現(xiàn)PpChi1、PpChi2和PpChi4的可溶性表達及分離純化,三種酶比活力分別為3.34 U/mg、2.96 U/mg和2.22 U/mg。PpChi3的可溶性較差,測得比活力為3.14U/mg。酶學性質(zhì)表征發(fā)現(xiàn),PpChi1、PpChi2和PpChi4的最適反應(yīng)溫度分別為45 ~oC、55 ~oC和50 ~oC。最適反應(yīng)pH均為5.0,且在pH 4.0-10.0區(qū)間內(nèi)均保持較好的pH穩(wěn)定性。不同金屬離子對三種重組甲殼素酶的影響不同。SDS對酶的抑制作用極為顯著。EDTA、Tween-80和TritonX-100對酶活力無顯著影響,表明三種甲殼素酶均不是金屬酶。β-巰基乙醇可使Pp Chi1活力降低,而對PpChi2和PpChi4無明顯影響,結(jié)合3D結(jié)構(gòu)分析,β-巰基乙醇可能會影響PpChi1結(jié)構(gòu)中二硫鍵(41C-61C,305C-316C)的穩(wěn)定。PpChi1、PpChi2和PpChi4顯示出對甲殼素粉末及膠體甲殼素很高的結(jié)合能力。TLC分析發(fā)現(xiàn),以膠體甲殼素為底物時,PpChi1和PpChi2以(GlcNAc)_2為主要終產(chǎn)物,PpChi4以GlcNAc為唯一終產(chǎn)物。PpChi1或PpChi2和PpChi4可以協(xié)同水解膠體甲殼素為GlcNAc。(3)針對PpChi1熱穩(wěn)定性差的問題,從PpChi1蛋白質(zhì)序列及結(jié)構(gòu)出發(fā),對PpChi1進行半理性改造以提高其熱穩(wěn)定性。通過單位點定點突變及組合突變,發(fā)現(xiàn)相比于PpChi1,突變體PpChi1-S244C-I319C/T259P(M3)在50 ~oC條件下的半衰期延長了26.3倍,由5.5 min提高至150 min,比活力提高1.3倍。最適反應(yīng)溫度增加7.5 ~oC,最適反應(yīng)pH仍為5.0,K_m為1.68 mg·mL~(-1),k_(cat)為941.2 min~(-1),V_(max)為13.4μmol·min~(-1)·mg~(-1),催化效率提高49.5%。結(jié)構(gòu)分析及分子動力學模擬表明,該突變體熱穩(wěn)定性的提高主要歸因于酶結(jié)構(gòu)剛性的增加。(4)針對催化過程中天然甲殼素結(jié)晶度高、水溶性差導(dǎo)致酶解效率低的問題,研究了5種離子液體及3種深度共熔溶劑預(yù)處理甲殼素對酶解效率的影響。結(jié)果表明,離子液體[BMIm]Ac預(yù)處理后甲殼素的酶解效率最高,而深度共熔溶劑預(yù)處理效果不明顯。利用SEM、FTIR和XRD對離子液體預(yù)處理后的甲殼素進行形貌及理化性質(zhì)表征,結(jié)果表明甲殼素經(jīng)[BMIm]Ac和[EMIm]Ac預(yù)處理并再生后,分子內(nèi)氫鍵網(wǎng)絡(luò)發(fā)生重排,表面粗糙度增加,結(jié)晶度降低,有利于酶與底物的接觸,甲殼素的酶解效率得到提高。進一步采用雙酶組合的方式水解經(jīng)[BMIm]Ac預(yù)處理的甲殼素,突變體M3+PpChi4與PpChi2+PpChi4兩種組合方式得到的GlcNAc的產(chǎn)率分別為786.6±16.5mg/g chitin和640.8±15.1 mg/g chitin。通過改變突變酶M3與PpChi4的添加順序,GlcNAc的產(chǎn)率進一步提高至864.5±14.5 mg/g chitin。此外,[BMIm]Ac重復(fù)使用8批次后,預(yù)處理的甲殼素水解為GlcNAc的產(chǎn)率仍為614 mg/g chitin。因此,離子液體預(yù)處理可有效提高甲殼素制備N-乙酰氨基葡萄糖的產(chǎn)率,實現(xiàn)甲殼素的最大化利用。
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第一章 緒論點的-4 位到-1 位區(qū)域。糖苷水解酶家族的其他酶通常以酸堿催化的方式例如，蛋清溶菌酶第 35 位的谷氨酸為質(zhì)子供體，第 52 位的天冬氨酸作夠穩(wěn)定反應(yīng)中間體。對于甲殼素酶，反應(yīng)中間體的穩(wěn)定則通過共價惡唑完成，其中的親和試劑為底物中的自由 N-乙酰氨基基團。 GH19 甲殼素酶

圖 2-1 產(chǎn)甲殼素酶菌株的分離鑒定流程圖-1 The flowchart of screening and identifying the strain producting采集萊州海力生物制品公司，樣品采集后置于塑封袋中，封口并做時送回實驗室。預(yù)處理0.0 g 固體樣品于含有 90 mL 生理鹽水的 250 mL 三角瓶中，，加下 180 rpm 震蕩 20 min，取出靜置 15 min，取上清作為液體樣分離理的上清液以 4%接種比接入含富集培養(yǎng)基的三角瓶中，37oC稀釋后涂布于固體分離培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱中 37oC 培
【學位授予單位】：華南理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TQ925

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 歐陽石文,趙開軍,馮蘭香,謝丙炎;植物幾丁質(zhì)酶的研究進展[J];生物工程進展;2001年04期

2 覃彩芹,肖玲,杜予民,樊木,施曉文;過氧化氫氧化降解殼聚糖的可控性研究[J];武漢大學學報(自然科學版);2000年02期

本文編號：2677139