【摘要】：功能性低聚糖可作為益生元使用,具有調(diào)節(jié)人體腸道菌群結(jié)構(gòu)、降低血脂、提高免疫力等生理功能,被廣泛應(yīng)用于功能食品、醫(yī)藥、飼料等領(lǐng)域。傳統(tǒng)的直接提取法、酸水解法或酶水解法等制備方法存在產(chǎn)物質(zhì)量差及產(chǎn)率低,操作步驟冗雜且成本較高等問題。而酶法合成低聚糖具有反應(yīng)條件溫和、體系簡單及產(chǎn)率高等優(yōu)點。右旋糖酐蔗糖酶可催化蔗糖水解成D-葡萄糖殘基并不斷轉(zhuǎn)移至糖鏈形成右旋糖酐;但小分子糖類受體存在時可催化D-葡萄糖殘基與受體連接合成低分子量的產(chǎn)物低聚糖。本課題針對低聚糖合成工藝存在的問題,通過小分子糖類受體干預(yù)反應(yīng)體系,研究右旋糖酐蔗糖酶不同受體反應(yīng)催化產(chǎn)物低聚糖的聚合機理,揭示外源受體對酶法合成右旋糖酐反應(yīng)的影響規(guī)律;在此基礎(chǔ)上引入右旋糖酐酶,研究雙酶法對受體反應(yīng)產(chǎn)物分子量及其分布的調(diào)控機制,以期為酶法催化受體反應(yīng)定向合成低聚糖奠定堅實的理論依據(jù)與實驗基礎(chǔ)。主要研究內(nèi)容及實驗結(jié)果如下:(1)右旋糖酐蔗糖酶受體反應(yīng)催化產(chǎn)物分析檢測方法的構(gòu)建�；谟倚囚崽敲复呋瘑蔚孜镎崽呛铣捎倚囚^程中低分子量產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn),構(gòu)建凝膠過濾色譜柱與氨基型親水相互作用色譜柱兩種檢測方法。通過對比分析,發(fā)現(xiàn)凝膠過濾色譜柱雙柱串聯(lián)可有效分離右旋糖酐蔗糖酶受體反應(yīng)中的多糖、低聚糖及單糖,跟蹤監(jiān)測產(chǎn)物分子量及其分布的變化情況;氨基型親水相互作用色譜柱可分離鑒別并定量分析不同聚合度的低聚糖及某些糖類的同分異構(gòu)體。同時,通過重復性、精密性及加標回收實驗證明了這兩種色譜柱檢測方法的精密性、重現(xiàn)性及穩(wěn)定性良好。(2)右旋糖酐蔗糖酶受體反應(yīng)合成低聚糖的過程規(guī)律及其機制研究。利用三種小分子糖類受體(葡萄糖、麥芽糖及乳糖)分別干預(yù)酶法合成右旋糖酐的反應(yīng)體系,探討了右旋糖酐蔗糖酶不同受體反應(yīng)催化產(chǎn)物低聚糖的聚合規(guī)律,研究了供受體比例、右旋糖酐蔗糖酶酶量及底物濃度對低聚糖和右旋糖酐的分子量及其分布、低聚糖產(chǎn)量及得率、蔗糖轉(zhuǎn)化率與受體轉(zhuǎn)化率的影響。實驗結(jié)果證明,在不同受體分子作用下右旋糖酐蔗糖酶均會同時催化兩種轉(zhuǎn)糖基反應(yīng),即受體反應(yīng)與多糖鏈延伸反應(yīng),聚合成兩種分子量差異極大的產(chǎn)物(低聚糖與右旋糖酐)。受體分子的強弱決定了兩種反應(yīng)的競爭程度,但受體的存在對糖鏈延伸反應(yīng)聚合形成副產(chǎn)物右旋糖酐的分子量(Mw106 Da)及其結(jié)構(gòu)影響不大,表明受體作用不會改變右旋糖酐蔗糖酶催化右旋糖酐聚合的活性位點。受體比例越大,其與受體產(chǎn)物及右旋糖酐糖鏈競爭D-葡萄糖殘基的能力越強,越容易合成低聚合度的產(chǎn)物,因此小分子量片段(3.6×102Da～103Da與103Da～104Da)所占比例不斷上升,平均分子量逐漸降低。但不同受體產(chǎn)物的聚合度有所差異,葡萄糖與麥芽糖的受體產(chǎn)物可以作為新的受體物質(zhì)不斷連接D-葡萄糖殘基而合成聚合度較高的低聚糖產(chǎn)物,其平均分子量均與受體比例、底物濃度及酶添加量成負相關(guān)關(guān)系;而乳糖受體反應(yīng)在不同條件下僅合成一種聚合度為3的低聚糖,分子量均為504 Da,說明不同受體產(chǎn)物低聚糖的聚合度與受體分子的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)密切相關(guān),以葡萄糖基為糖單元的受體分子更容易被右旋糖酐蔗糖酶識別與利用而合成聚合度不同的系列低聚糖。此外,相對于葡萄糖與乳糖的受體產(chǎn)物,麥芽糖受體產(chǎn)物的小分子量片段(3.6×102Da～103Da與103Da～104Da)所占比例較大且麥芽糖轉(zhuǎn)化率較高,說明麥芽糖分子與右旋糖酐蔗糖酶的親和識別作用力較強,可吸附更多的右旋糖酐蔗糖酶促進糖基化聚合反應(yīng),使其受體產(chǎn)物低聚糖的得率較高;而葡萄糖與乳糖受體反應(yīng)產(chǎn)物中大分子量片段(105 Da～106Da及106Da)所占比例較大,受體產(chǎn)物低聚糖得率與受體轉(zhuǎn)化率均較低,體系合成了較多的副產(chǎn)物右旋糖酐,因此麥芽糖是右旋糖酐蔗糖酶的強受體物質(zhì),葡萄糖和乳糖是右旋糖酐蔗糖酶的弱受體物質(zhì)。(3)利用右旋糖酐酶降解作用調(diào)控低聚糖合成過程的研究。小分子糖類受體的加入可以在一定程度上實現(xiàn)低聚糖的定向制備,但體系中會存在較多的副產(chǎn)物右旋糖酐。為了使副產(chǎn)物得到最大程度的利用,引入右旋糖酐酶對其分子量進行調(diào)控。結(jié)果發(fā)現(xiàn)右旋糖酐酶主要對大分子量右旋糖酐起降解作用而對麥芽糖受體反應(yīng)的影響較小,反應(yīng)趨向于合成聚合度較低的低聚糖。隨著右旋糖酐酶酶量的增加,反應(yīng)產(chǎn)物中大分子量片段(105 Da)被充分降解,小分子量片段(103 Da)所占比例不斷增大,平均分子量不斷降低的同時分子量分布逐漸變窄,說明右旋糖酐酶可有效調(diào)控產(chǎn)物分子量及其分布,產(chǎn)生結(jié)構(gòu)更豐富多樣的低聚糖;同時,供受體轉(zhuǎn)化率幾乎保持不變,低聚糖得率與右旋糖酐酶酶量成正相關(guān)關(guān)系。此外,在0.3 M蔗糖溶液、不同供受體比例的反應(yīng)體系中,產(chǎn)物低聚糖平均分子量變化遵循經(jīng)典Malhortra模型,擬合關(guān)系良好。
【圖文】：

圖１－１右旋糖酐蔗糖酶的三維結(jié)構(gòu)圖［ｌ８］逡逑Ａ：藍色區(qū)域；Ｂ：綠色區(qū)域；Ｃ：紫色區(qū)域；ＩＶ：黃色區(qū)域；Ｖ：紅色區(qū)域逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｄｅｘｔｒａｎｓｕｃｒａｓｅ逡逑

由于右旋糖酐蔗糖酶具有蔗糖水解酶和糖苷轉(zhuǎn)移酶兩種催化活性，其催化作逡逑用過程分為：一催化蔗糖水解過程，獲得增長鏈的能量及葡萄糖殘基；二利用轉(zhuǎn)逡逑糖基作用轉(zhuǎn)移葡萄糖殘基至糖鏈或小分子受體物質(zhì)上的鏈增長過程［２６］。如圖１－３逡逑所示，當右旋糖酐蔗糖酶催化蔗糖分子水解得到葡萄糖基－酶中間體后，根據(jù)受逡逑體的不同，催化糖基轉(zhuǎn)移的反應(yīng)分為兩種ｔ２７，２８］：邋（１）以水作為受體的水解反應(yīng)，逡逑使葡萄糖基－酶中間體形成游離的葡萄糖；（２）非水物質(zhì)受體的轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，，又逡逑可分為：（ｉ）高分子量右旋糖酐的合成，以葡萄糖鏈為受體，主要延伸糖鏈的葡逡逑萄糖基結(jié)合部位；（ｉｉ）糖基化反應(yīng)，以小分子糖類受體物質(zhì)存在時，通過轉(zhuǎn)糖基逡逑作用合成一系列新的功能性糖類化合物，也稱為右旋糖酐蔗糖酶受體反應(yīng)。受體逡逑分子非還原性末端的羥基會對酶－葡萄糖基中間產(chǎn)物的Ｃ１位進行親核攻擊，使葡逡逑萄糖基轉(zhuǎn)移到它們的非還原性末端
【學位授予單位】：廣西大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TQ281

【參考文獻】

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本文編號：2676875