發(fā)布時間：2020-05-23 00:43

【摘要】：2,3-丁二醇是一種重要的化工原料,廣泛用于化工、食品、燃料以及航空航天等多個領域。木糖是木質(zhì)纖維原料水解產(chǎn)物中含量僅次于葡萄糖的一種單糖,因此,充分利用纖維素原料中的木糖、提高木糖2,3-丁二醇的轉(zhuǎn)化率是高效利用纖維素原料生產(chǎn)2,3-丁二醇的關鍵問題之一。本研究通過對具有高木糖耐性肺炎克雷伯氏菌株的差異基因進行RT-PCR驗證和基因功能驗證,對高效利用木糖的代謝機理進行了初步解析,并優(yōu)化了該菌株的發(fā)酵條件,最后為提高2,3-丁二醇的產(chǎn)量對其進行基因工程改造,研究結(jié)果對于肺炎克雷伯氏菌高效利用木糖提供了理論意義和使用價值,對2,3-丁二醇的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了堅實的基礎,同時也為其它菌株代謝木糖的研究提供了有意義的參考。1)對差異基因中上調(diào)的基因過表達,下調(diào)基因敲除,并選取了 9個基因進行RT-PCR的驗證。結(jié)果表明,跨膜轉(zhuǎn)運相關的基因、參與戊糖磷酸途徑的關鍵基因、糖酵解途的關鍵基因以及信號轉(zhuǎn)導和電子傳遞相關基因表達量的提高,可以提高高木糖濃度條件下菌株耗糖能力和2,3-丁二醇的生產(chǎn)能力;減弱與2,3-丁二醇的生產(chǎn)競爭碳源和NADH的副產(chǎn)物途徑,木糖消耗和2,3-丁二醇的得率也有一定的提高;RT-PCR驗證RNA-seq差異基因表達量的結(jié)果顯示,RT-PCR的表達量與RNA-seq的上下調(diào)趨勢一致。2)在1L生物反應器水平對適應性進化篩選出的具有高木糖耐性的肺炎克雷伯氏菌株應用響應面法優(yōu)化了其產(chǎn)2,3-丁二醇的發(fā)酵條件,得到最優(yōu)發(fā)酵條件為:pH 5.9、溫度35 ℃、轉(zhuǎn)速230 r/min、通氣量0.7 L/min,最優(yōu)條件下2,3-丁二醇產(chǎn)量高達43.75 g/L,相比優(yōu)化前提高32.7%。3)完全敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc,琥珀酸的產(chǎn)量和得率都有大幅度降低,菌株的生長速度變慢,但突變菌株2,3-丁二醇的得率比親本菌株提高了 27%,理論轉(zhuǎn)化率(50%)提高了 21%。敲除ppc啟動子突變菌株的木糖利用和2,3-丁二醇的生成速度都有所降低,但2,3-丁二醇的得率略有提高。敲除催化富馬酸生成琥珀酸的富馬酸還原酶基因frdA 和frdBC,琥珀酸的含量略有降低,與原始菌株比較分別降低了 16.27%和25%,2,3-丁二醇的產(chǎn)量分別提高了 7.8%和10.2%,代謝副產(chǎn)物乙醇的含量分別提高了 13.14%和17.26%。
【圖文】：

ＣＨ３ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３，其中因為其分子結(jié)構手性碳原子有兩個，因此該物質(zhì)能以３逡逑種立體異構體的形式存在，分別為（Ｒ，Ｒ）－２，３－丁二醇（左旋型）、ｍｅｓｏ－２，３－丁二醇（內(nèi)逡逑消旋型）和（Ｓ，Ｓ）－２，３－丁二醇（右旋型），其結(jié)構如圖１－１所示［１］。逡逑０邐Ｈ邐０Ｈ邐０邋Ｈ逡逑１邐｝邐＾逡逑ＣＨ３逡逑＼邋ｃｈ３邋Ｈ３Ｃ邐：邐：邐ｃｈ３逡逑Ｉ邐￡邐￡逡逑ＯＨ邐ＯＨ邐ＯＨ逡逑Ｌ－＜＋）－２，３－ＢＤ邐ｍｅｓｏ－２，３－ＢＤ邐０－ｆ－＞２，３－ＢＤ逡逑Ｄｅｘｔｒｏｒｏｔａｔｏｒｙ邋ｆｏｒｍ邐Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ邋ｉｎａｃｔｉｖｅ邋ｆｏｒｍ邐Ｌｅｖｏｒｏｔａｔｏｒｙ邋ｆｏｒｍ逡逑（２Ｓ，３Ｓ）邐（２Ｒ，３Ｒ）逡逑圖１－１邋２，３－丁二醇三種立體異構體逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｔｈｒｅｅ邋ｓｔｅｒｅｏｉｓｏｍｅｒｓ邋ｏｆ邋２，３－ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ逡逑三種旋光異構體的理化性質(zhì)列于表１－１。逡逑表１－１邋２

在細菌代謝中，單糖首先必須先轉(zhuǎn)化成丙酮酸，然后再生成主要產(chǎn)品。從葡萄糖逡逑通過糖酵解途徑以相對簡單的方式形成丙酮酸。相比之下，戊糖的丙酮酸生產(chǎn)必須通逡逑過磷酸戊糖途徑和糖酵解途徑的組合進行［５９］。如圖１－２所示丙酮酸生成２，３－ＢＤ是混逡逑合酸發(fā)酵途徑，，除了邋２，３－ＢＤ之外，生成的中間產(chǎn)物有ａ－乙酰乳酸、乙偶姻和雙乙酰；逡逑主要副產(chǎn)物有琥珀酸、乳酸、乙酸、乙醇、甲酸等。及抑７／}＾沖；￥0菌株利用葡萄逡逑糖合成２，３－丁二醇過程中轉(zhuǎn)化為其他副產(chǎn)物的代謝反應如下［２８］：逡逑Ｇｌｕｃｏｓｅ邋—？邋６Ｃ０２邋＋邋４ＡＴＰ＋１０ＮＡＤＨ２逡逑Ｇｌｕｃｏｓｅ＋邋３Ｈ２０邋２ａｃｅｔａｔｅ＋邋２Ｃ０２邋＋邋４ＡＴＰ＋邋２ＮＡＤＨ２邋＋邋２Ｈ２逡逑Ｇｌｕｃｏｓｅ邋—？邋ａｃｅｔｏｉｎ邋＋邋２Ｃ0２邋＋邋２ＡＴＰ＋邋２ＮＡＤＨ２逡逑Ｇｌｕｃｏｓｅ邋—？邋ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ邋＋邋２Ｃ0２邋＋邋２ＡＴＰ＋邋ＮＡＤＥｂ逡逑Ｇｌｕｃｏｓｅ＋邋２ＮＡＤＨ２￣？邋２ｅｔｈａｎｏｌ＋邋２Ｃ0２邋＋邋２ＡＴＰ＋邋２Ｈ２逡逑Ｇｌｕｃｏｓｅ邋—？邋２１ａｃｔａｔｅ＋邋２ＡＴＰ逡逑丙酮酸生成２，３－丁二醇的過程中涉及三種關鍵的酶，即ａ－乙酰乳酸合成酶逡逑（ａ－ＡＬＳ）、ａ－乙酰乳酸脫羧酶（ａ－ＡＬＤ）和２，３－丁二醇脫氫酶（ＢＤＨ，又名乙偶姻逡逑還原酶，ＡＲ）邋，邋ａ－乙酰乳酸合成酶進行兩步反應：在初始階段，丙酮酸與焦硫酸硫胺逡逑５逡逑
【學位授予單位】：天津科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：TQ223.162;TQ920.1

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