【摘要】：D-1,2,4-丁三醇(D-1,2,4-butanetriol,BT)是一種重要的非天然四碳平臺化合物,廣泛應(yīng)用于軍工、醫(yī)藥、煙草等領(lǐng)域。近年來,研究者對重組大腸桿菌進行敲除分支代謝途徑、過表達關(guān)鍵酶及分子伴侶輔助蛋白折疊等改造加強BT合成通路,但產(chǎn)量仍然有限。其中,木糖分支途徑缺失不利于生物量積累,低效率的脫羧反應(yīng)是BT合成的限速步驟�；诖�,本研究首先通過篩選高效脫羧酶解除限速步驟,其次分別采用反義RNA技術(shù)微調(diào)木糖代謝流及弱化葡萄糖效應(yīng)實現(xiàn)葡萄糖、木糖共底物發(fā)酵的策略提高菌體生物量,最后通過培養(yǎng)條件優(yōu)化實現(xiàn)BT高產(chǎn)。脫羧反應(yīng)是BT合成途徑的限速步驟。為提高脫羧效率,分別從乳酸乳球菌和陰溝腸桿菌基因組中克隆2-酮異戊酸脫羧酶基因kivD及吲哚丙酮酸脫羧酶基因ipdC,并構(gòu)建重組表達菌株。SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)重組蛋白表達水平相似。發(fā)酵結(jié)果顯示,攜帶kivD基因的重組菌株盡管生物量略有降低,但BT產(chǎn)量較對照菌株提高53%,達到1.3 g·L~(-1)。而攜帶ipdC基因菌株發(fā)酵液中并未檢測到BT。上述結(jié)果表明來自乳酸乳球菌的2-酮異戊酸脫羧酶KivD能高效催化BT合成途徑的脫羧反應(yīng)。為了提高菌株生長能力,采用反義RNA技術(shù)微調(diào)木糖異構(gòu)酶表達水平以平衡菌體生長及BT合成。四個反義表達菌株的Xyl A轉(zhuǎn)錄水平均受到不同程度抑制,且菌體生物量及BT產(chǎn)量均得到相應(yīng)提高;BT最高產(chǎn)量達到3.9 g·L~(-1),比對照菌株提高200%。此外,通過對葡萄糖效應(yīng)相關(guān)基因敲除,發(fā)現(xiàn)ptsHI、mgsA基因敲除可以有效弱化葡萄糖效應(yīng)實現(xiàn)葡萄糖、木糖共底物發(fā)酵。與出發(fā)菌株相比,ptsHI、mgsA雙缺菌株生物量提高1.1倍,BT產(chǎn)量提高6.5倍達到6.0 g·L~(-1)。與反義RNA重組表達菌株相比,葡萄糖效應(yīng)弱化菌株具有明顯發(fā)酵優(yōu)勢,并將其作為后續(xù)研究出發(fā)菌株。為進一步提高BT產(chǎn)量,對發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖、木糖及LB濃度進行優(yōu)化并通過添加CaCO_3來調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH,搖瓶培養(yǎng)重組菌株BT產(chǎn)量提高至12.2 g·L~(-1)。隨后對發(fā)酵罐培養(yǎng)條件進行優(yōu)化,在5 L發(fā)酵罐中,經(jīng)分批補料發(fā)酵BT產(chǎn)量達到14.9 g·L~(-1)。最后,嘗試以蔗渣水解液為底物發(fā)酵合成BT,在初始木糖8.4 g·L~(-1)、葡萄糖16.8 g·L~(-1)的蔗渣水解液中重組大腸桿菌展現(xiàn)出較強的發(fā)酵性能,BT產(chǎn)量達到3.5 g·L~(-1),摩爾轉(zhuǎn)化率高達84.8%。值得注意的是,本研究的搖瓶發(fā)酵及上罐發(fā)酵水平均優(yōu)于已有報道。
【圖文】：

2,4-丁三醇的分子結(jié)構(gòu)式g. 1-1 Molecular Structure of 1,2,4-butane為前體物質(zhì)可用來合成丁三醇三有沖擊性小、熱穩(wěn)定性高、揮發(fā)軍工領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用[1-5]；BTT物的合成[6-10]；BT 作為煙草行業(yè)；在彩色顯影液中添加 BT 可以三醇 主要是化學(xué)合成法，商業(yè)化生產(chǎn)u-Re，Cu-Al 在高溫高壓下將蘋果酯還原為 BT[14, 15]。此外，，通過對醇(BTD)酸催化法[16]、BTD 氧化路線同樣具有工業(yè)應(yīng)用價值[18]。

圖 1-2 重組大腸桿菌以 D-木糖為底物發(fā)酵合成 D-1,2,4-丁三醇Fig. 1-2 The synthetic pathway of BT from xylose in E. coli表 1-1 1,2,4-丁三醇生物合成國內(nèi)外研究水平Table 1-1 The research level of 1,2,4-butanetriol biosynthesis at home and abroad研究機構(gòu)Institutions研究策略Strategy培養(yǎng)條件CultivationConditionsBT 產(chǎn)量BT titer韓國明治大學(xué)構(gòu)建缺失菌 E. coli W3110 (DE3)ΔxylABΔyagEΔyjhH，利用雙質(zhì)粒分別表達木糖脫氫酶 xdh 基因與苯甲酰甲酸脫羧酶 mdlC 基因，首次獲得直接合成 BT 的重組菌LB，10 g·L-1木糖 0.88 g·L-1青島能源所構(gòu)建重組表達菌株 E. coli BL21ΔxylAB/pE-mdlCxylBC&pA-adhPyjhG5 L 罐發(fā)酵分批補料發(fā)酵，木糖添加量 20 g·L-13.92 g·L-1科學(xué)院微生物研究所在 E. coli BW25113 敲除 yagE、yjhH、yiaE、ycdW 和 xylAB 基因，篩選高效的 2-酮酸脫以 LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)菌體，并在補加 20 g·L-1木糖2.38 g·L-1
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：TQ923

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本文編號：2672329