發(fā)布時間：2020-05-20 04:27

【摘要】：槐糖脂是一類由酵母菌產(chǎn)生的生物表面活性劑,與化學(xué)工業(yè)合成的表面活性劑相比,槐糖脂低毒或無毒,環(huán)境相容性好,具有良好的分散、乳化、增溶性能等優(yōu)點(diǎn),此外,還具有抗腫瘤、抗病毒、抑制白細(xì)胞增長等特點(diǎn)。良好的特性使槐糖脂在日化、石油、環(huán)境保護(hù)、醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用日益廣泛。目前,限制槐糖脂工業(yè)化大規(guī)模制備和應(yīng)用的主要因素是發(fā)酵成本過高,其中,發(fā)酵過程中氧氣的供給和利用水平低導(dǎo)致油溶性底物利用率低、發(fā)酵周期長是限制其降低成本的關(guān)鍵因素之一。球擬假絲酵母在利用脂溶性碳源合成槐糖脂的過程中,脂肪酸的羥基化是槐糖脂合成的關(guān)鍵步驟,該反應(yīng)需要消耗大量氧氣,在高密度發(fā)酵過程中,菌體細(xì)胞生長和槐糖脂合成過程中溶解氧水平往往成限制因素。通過增加通氣量、加快攪拌速度、提高罐壓等方法改善發(fā)酵過程中的溶氧固然可行,但這些措施對設(shè)備強(qiáng)度等要求較高,且二氧化碳分壓過高還會限制細(xì)胞的生長。因此,尋求一種即能增加細(xì)胞對氧氣的利用效率又不需要大量耗能的手段勢在必行。已有研究表明,透明顫菌血紅蛋白(VHb)能夠從分子水平上提高基因克隆菌對氧氣的利用能力,其應(yīng)用不僅可以降低氧氣及能量的消耗,還不需要附加的設(shè)備投資,進(jìn)而大大降低發(fā)酵成本。本研究利用現(xiàn)代分子生物學(xué)基因重組技術(shù),將透明顫菌血紅蛋白基因vgb的編碼序列電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入球擬假絲酵母O-13-1菌株中,篩選到陽性轉(zhuǎn)化子VHb~+,根據(jù)菌體顏色和CO差光譜法驗(yàn)證了VHb蛋白的生物學(xué)活性。含VHb基因重組菌的成功構(gòu)建,為研究VHb對槐糖脂發(fā)酵的影響提供了實(shí)驗(yàn)材料。透明顫菌血紅蛋白基因?qū)碧侵l(fā)酵生產(chǎn)影響的研究結(jié)果顯示,搖瓶實(shí)驗(yàn)中,重組菌株VHb~+槐糖脂產(chǎn)量高于原始菌株VHb~-;5L發(fā)酵罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在富氧條件(轉(zhuǎn)速400 rpm、通氣量1.0 vvm)下,二者的生物量和槐糖脂產(chǎn)量差異不大,但在槐糖脂合成階段,VHb~+菌株的耗氧量比VHb~-菌株平均低21.8%;在貧氧條件(轉(zhuǎn)速350 rpm、通氣量1 vvm)下,VHb~+菌株在發(fā)酵過程中對溶氧的利用明顯改善,其槐糖脂產(chǎn)量比VHb~-菌株提高了25.1%。采用qPCR方法研究了VHb的作用機(jī)理,結(jié)果顯示,發(fā)酵24h時重組菌株VHb~+的TCA循環(huán)、呼吸鏈和槐糖脂合成關(guān)鍵酶基因相對表達(dá)水平相差不大,而72h時(槐糖脂生物合成的指數(shù)增長期),VHb~+菌株在這三條代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因表達(dá)水平明顯增加,表明vgb的表達(dá)通過增加TCA循環(huán)與呼吸鏈的活性,提高了細(xì)胞內(nèi)氧氣的利用效率,從而促進(jìn)了槐糖脂的合成。綜上所述,VHb基因的異源表達(dá)提高了菌株O-13-1對氧氣的利用效率,提高了貧氧條件下的槐糖脂產(chǎn)量,是緩解低供氧對其槐糖脂發(fā)酵限制的有效方法。本研究通過單次單因素實(shí)驗(yàn)方法優(yōu)化了重組菌株VHb~+的發(fā)酵溶氧條件,在轉(zhuǎn)速、通氣量和罐壓分別為350 rpm、0.6 vvm和0.04 Mpa時有利于槐糖脂的發(fā)酵生產(chǎn),該條件下的槐糖脂產(chǎn)量、生物量及發(fā)酵液中的溶氧相對較高,且最終槐糖脂呈透明狀粘稠液體,易于通過自然沉降法分離。因此,在工業(yè)發(fā)酵中,保證發(fā)酵液中合適的溶氧,對提高槐糖脂的產(chǎn)量有重要意義。通過透明顫菌血紅蛋白基因vgb在球擬假絲酵母O-13-1中的表達(dá),從分子水平上增加了細(xì)胞內(nèi)氧的傳遞速率,提高了氧的利用效率。這一策略,為解決槐糖脂發(fā)酵過程中供氧不足問題提供了一條新的途徑,為節(jié)能降耗提供依據(jù),具有良好的應(yīng)用前景。
【圖文】：

乳化和分散性能。與化學(xué)工業(yè)合成的表面活性劑相比，槐糖脂作為一種可降解的生物表面活性劑，其生產(chǎn)菌株為非致病菌，與人體和環(huán)境有良好的相容性。除此以外，槐糖脂具有良好的分散、乳化、增溶特性等優(yōu)點(diǎn)，還具有很好的抗腫瘤、抗病毒、抑制白細(xì)胞的增長等特點(diǎn)，為生物分子、細(xì)胞膜、細(xì)胞器以及醫(yī)用生物制品的研究和使用帶來了極大方便，為人類健康作出很大的貢獻(xiàn)，具有巨大的研究價值和經(jīng)濟(jì)效益。1.1.1 槐糖脂的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)微生物天然合成的槐糖脂是由一系列槐糖脂分子組合成的混合物。這些槐糖脂分子的共同特點(diǎn)都是由親水性的槐糖(2 個葡萄糖分子以 β-1,2 糖苷鍵結(jié)合)和疏水性飽和或不飽和的長鏈 ω-(或 ω-1) 羥基脂肪酸兩部分共同構(gòu)成[1]，區(qū)別在于它們所含脂肪酸的碳鏈長度不同、飽和或不飽和的程度不同以及羥基脂肪酸的羥基位置不同，結(jié)構(gòu)的差異使得槐糖脂的理化性質(zhì)也存在差異[2]�；碧侵� 2 種類型： 內(nèi)酯型、酸型(見圖 1-1)[2]。內(nèi)酯型槐糖脂抑菌能力較強(qiáng)，可以較好地降低表面張力；而酸型槐糖脂有較好的泡沫形成能力和溶解性[3]。

隨著社會環(huán)保意識的增強(qiáng)，槐糖脂的研究越來越受種陸續(xù)被篩選出來，擴(kuò)大了原有生物表面活性劑合成菌母 Wickerhamiella domercqiae[4]和畢赤酵母 Pichia anom的一些假絲酵母如 C. batistae、C. riodocensis、C.stellata。此外，在其它不同的屬甚至門中也發(fā)現(xiàn)了合成槐糖脂的 bogoriensis 就是擔(dān)子菌屬的，，其整體槐糖脂結(jié)構(gòu)類似于 肪酸摩爾數(shù)不同。本論文所用的槐糖脂產(chǎn)生菌就是球la bombicola）O-13-1 菌株。的合成究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)物槐糖脂合成的理論途徑大致如圖所示（圖程主要需要 2 種前體物質(zhì): UDP-葡萄糖和脂肪酸。從圖的合成先需要進(jìn)行脂肪酸的羥基化。脂肪酸可以直接從外脂肪酶水解甘油三酯、脂肪酸酯等底物來獲得，也可以端氧化的酶，逐步轉(zhuǎn)化烷烴獲得。如果培養(yǎng)基中沒有疏糖酵解途徑，利用乙酰-CoA 從頭開始合成脂肪酸。
【學(xué)位授予單位】：青島科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TQ920.1

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李睿穎;;槐糖脂的前景及在農(nóng)村經(jīng)濟(jì)中的價值[J];農(nóng)民致富之友;2016年08期

2 陳天翔;曲木;呂春雙;李嫦娥;白東清;孫金輝;喬秀亭;程鎮(zhèn)燕;;飼料不同糖脂比對鯉魚生長、免疫及抗氧化相關(guān)酶活性的影響[J];天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報;2016年01期

3 李俊峰;門晉名;王裕寬;劉杰;李紅芳;;槐糖脂的生物合成及最新應(yīng)用[J];應(yīng)用化工;2013年02期

4 梁吉虎;;槐糖脂的研究進(jìn)展[J];應(yīng)用化工;2011年01期

5 劉青芝;郭學(xué)平;朱希強(qiáng);;槐糖脂的微生物合成及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J];食品與藥品;2009年11期

6 陳靜;張云瑞;宋欣;;槐糖脂的生產(chǎn)及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J];食品科學(xué);2007年08期

7 王維通;;鞘氨醇糖脂的結(jié)構(gòu)、分離及檢測[J];國外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊);1987年01期

8 朱正美;;鞘氨醇糖脂分解代謝中的蛋白激活因子[J];國外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊);1987年01期

9 黃芬,趙寶貞,文德成,錢玉民;萊氏衣原體膜糖脂組成及相變行為[J];科學(xué)通報;1988年14期

10 李祖義;徐永珍;李江云;孫常麒;許興妹;施邑屏;;一種細(xì)菌糖脂的化學(xué)結(jié)構(gòu)和物化性能[J];化學(xué)學(xué)報;1988年03期

相關(guān)會議論文 前10條

1 劉青芝;郭學(xué)平;;槐糖脂的微生物合成及其應(yīng)用研究進(jìn)展[A];2009年中國藥學(xué)大會暨第九屆中國藥師周論文集[C];2009年

2 劉青芝;郭學(xué)平;;槐糖脂的微生物合成及其應(yīng)用研究進(jìn)展[A];2010年中國藥學(xué)大會暨第十屆中國藥師周論文集[C];2010年

3 婁淑杰;蔡明;李鋒;李靜靜;;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控高糖脂誘導(dǎo)的海馬細(xì)胞炎癥反應(yīng)[A];第四屆（2016）全國運(yùn)動生理與生物化學(xué)學(xué)術(shù)會議——運(yùn)動·體質(zhì)·健康論文摘要匯編[C];2016年

4 宋丹丹;梁生康;;槐糖脂生物表面活性劑的結(jié)構(gòu)特征及理化性質(zhì)初步研究[A];中國化學(xué)會第27屆學(xué)術(shù)年會第02分會場摘要集[C];2010年

5 劉丹陽;徐首紅;劉洪來;;偶氮苯糖脂的合成及其在光控釋藥脂質(zhì)體中的應(yīng)用[A];中國化學(xué)會第29屆學(xué)術(shù)年會摘要集——第26分會：膠體與界面[C];2014年

6 張德芹;李玉紅;王濤;安雅婷;劉虹;王茜;;糖脂清對實(shí)驗(yàn)性高脂血癥大鼠糖脂代謝的影響[A];全國第3屆臨床中藥學(xué)學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

7 陳德瑩;徐繼林;嚴(yán)小軍;李海英;;甘油糖脂的UPLC-Q-TOF-MS研究[A];2008年全國有機(jī)質(zhì)譜學(xué)術(shù)會議論文集[C];2008年

8 和彩玲;尹虹;張定華;張瑩麗;王潔敏;王收寶;辛燕;蒲華麗;;糖脂平方對非增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病損傷的影響[A];中華中醫(yī)藥學(xué)會糖尿病分會全國中醫(yī)藥糖尿病大會（第十九次）資料匯編[C];2018年

9 胡富強(qiáng);;糖脂結(jié)構(gòu)新材料遞釋系統(tǒng)的分子設(shè)計與評價[A];2016年中國藥學(xué)大會暨第十六屆中國藥師周資料匯編[C];2016年

10 戢璐;謝華;陳敏;陳艷秋;孫建琴;高臻輝;李茹;黃承鈺;;高尿酸并糖脂異常人群膳食與運(yùn)動調(diào)查分析[A];生命發(fā)展機(jī)遇——窗口期營養(yǎng)——達(dá)能營養(yǎng)中心第十二屆學(xué)術(shù)年會會議論文集[C];2009年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 記者 潘瑩;新疆：假“糖脂寧”源自遼寧,曾購者逾400[N];新華每日電訊;2009年

2 記者賈小紅;我區(qū)藥監(jiān)部門緊急查控假“糖脂寧”[N];新疆日報(漢);2009年

3 記者 劉一兵 李志宏 實(shí)習(xí)記者 裴麗娟;我區(qū)迅速徹查涉嫌假“糖脂寧”致人死亡案[N];喀什日報(漢);2009年

4 記者 胡德榮;糖脂“角斗士”對超級細(xì)菌有奇效[N];健康報;2015年

5 李勇強(qiáng)　許恒;舉一反三應(yīng)對“糖脂寧事件”[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報;2009年

6 通訊員 房樹芬 記者 姜澎;糖脂角斗士能解超級細(xì)菌武裝[N];文匯報;2015年

7 本報記者 劉洪文 通訊員 莊海東;醫(yī)療機(jī)構(gòu)不得拒收拒治服假“糖脂寧”患者[N];阿克蘇日報;2009年

8 本報記者 李寧艷　通訊員 王伯明;“加料糖脂寧”連害兩命[N];烏魯木齊晚報;2010年

9 本報記者 潘從武　通訊員 劉芳;假“糖脂寧”事件暴真相[N];法制日報;2009年

10 本報記者 白毅;“糖脂寧事件”再撞用藥“安全門”[N];中國醫(yī)藥報;2009年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 劉璇;治療腫瘤原生性及繼發(fā)性轉(zhuǎn)移的糖脂嫁接物藥物遞釋系統(tǒng)的構(gòu)建與評價[D];浙江大學(xué);2017年

2 陳靜;槐糖脂產(chǎn)生菌的篩選及槐糖脂抑菌和抗腫瘤作用的研究[D];山東大學(xué);2006年

3 邵凌健;槐糖脂補(bǔ)料發(fā)酵及抗真菌、抗腫瘤活性的研究[D];山東大學(xué);2010年

4 李慧;槐糖脂產(chǎn)生菌擬威克酵母的誘變育種、遺傳改造及槐糖脂體內(nèi)和體外抗腫瘤機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2013年

5 馬曉靜;槐糖脂合成的氮源代謝調(diào)控及槐糖脂的廉價底物生產(chǎn)和性質(zhì)研究[D];山東大學(xué);2012年

6 李加山;球擬假絲酵母Starmerella bombicola槐糖脂合成、代謝相關(guān)基因功能的研究[D];山東大學(xué);2016年

7 張犁;糖脂清對2型糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞功能的影響及機(jī)理研究[D];南京中醫(yī)藥大學(xué);2011年

8 呂佳t

本文編號：2672050