【摘要】：所有的生物中氨基葡萄糖(GlcN)都是必不可少的,其中包括細(xì)菌、真菌、植物以及動(dòng)物。GlcN是糖蛋白、殼聚糖和甲殼素的主要組成成分。氨基葡萄糖合成酶(GlmS)將果糖-6-磷酸和谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為氨基葡萄糖-6-磷酸和谷氨酸。GlmS在大腸桿菌中的過(guò)表達(dá)增加了氨基葡萄糖-6-磷酸的合成,氨基葡萄糖-6-磷酸被脫磷酸化并以氨基葡萄糖的形式分泌到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。本實(shí)驗(yàn)使用PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)飽和突變對(duì)大腸桿菌glmS基因進(jìn)行改造,以開(kāi)發(fā)出適合發(fā)酵生產(chǎn)氨基葡萄糖的微生物菌株。氨基葡萄糖合酶(GlmS)過(guò)表達(dá)可以提高氨基葡萄糖的產(chǎn)量。將枯草芽孢桿菌中的氨基葡萄糖合酶基因(glmS),連接到表達(dá)載體pET-28a上得到重組質(zhì)粒pET-28a-glmS,然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中,成功構(gòu)建了在發(fā)酵過(guò)程中氨基葡萄糖產(chǎn)量明顯增加的工程菌E.coli BL21-pET-28a-glmS。對(duì)構(gòu)建的工程菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,當(dāng)發(fā)酵16 h時(shí),發(fā)酵液中氨基葡萄糖產(chǎn)量達(dá)到最高為1.01 g/L。對(duì)GlmS進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定,其最適反應(yīng)溫度為37℃,最適反應(yīng)pH為7.5。通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬分析預(yù)測(cè)氨基葡萄糖合酶空間結(jié)構(gòu),理性分析選取保守性低的氨基酸位點(diǎn),然后根據(jù)glmS序列設(shè)計(jì)突變引物對(duì)構(gòu)建的質(zhì)粒pET-28a-glmS進(jìn)行PCR介導(dǎo)的全質(zhì)粒定點(diǎn)飽和突變。將獲得的突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中,誘導(dǎo)表達(dá)。通過(guò)檢測(cè)氨基葡萄糖合酶的活性,篩選得到了四株(L601H、A602C、K603T、S604G)比原始酶酶活提高的菌株,其酶活分別提高了43.3%、34.6%、55.3%及50%。對(duì)突變型氨基葡萄糖合酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定,發(fā)現(xiàn)其最適的反應(yīng)溫度為37℃,最適反應(yīng)pH為7.5。使用菌株E.coli BL21、E.coli BL21-pET-28a-glmS、突變菌L601H、A602C、K603T、S604G進(jìn)行了發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。篩選得到優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖濃度為50 g/L、蛋白胨濃度為10 g/L、酵母浸粉濃度為20 g/L、MnCl_2濃度為20 mg/L。通過(guò)搖瓶發(fā)酵檢測(cè)發(fā)酵液中GlcN的產(chǎn)量,L601H的發(fā)酵液中的GlcN產(chǎn)量達(dá)到1.45 g/L。A602C的發(fā)酵液中GlcN產(chǎn)量達(dá)到1.3 g/L。K603T的發(fā)酵液中GlcN產(chǎn)量達(dá)到1.1 g/L。S604G的發(fā)酵液中GlcN產(chǎn)量量達(dá)到1.0 g/L。
【圖文】：

大腸桿菌氨基葡萄糖代謝途徑Fig.1.1GlucosaminemetabolicpathwayinE.coli

實(shí)驗(yàn)流程圖
【學(xué)位授予單位】：齊魯工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：TQ920.6

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 倪冉熹;詹豪強(qiáng);;D-氨基葡萄糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及合成[J];同行;2016年15期

2 劉麗華;;解密關(guān)節(jié)“軟黃金”:氨基葡萄糖[J];中南藥學(xué)(用藥與健康);2016年10期

3 余磊;;氨基葡萄糖在骨性關(guān)節(jié)炎治療中的作用分析[J];健康之路;2017年06期

4 劉瑋煒;李曲祥;程峰昌;張強(qiáng);霍云峰;;D-氨基葡萄糖N-位和苷羥基化學(xué)改性的研究進(jìn)展[J];化學(xué)通報(bào);2014年11期

5 陳慶陽(yáng);許建中;夏金梅;鐘添華;許晨;;高效液相色譜-核粒子計(jì)數(shù)檢測(cè)氨基葡萄糖類(lèi)化合物[J];廈門(mén)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2012年06期

6 孫濤;巢駿;熊小英;康永鋒;謝晶;;C_(60)-D-氨基葡萄糖衍生物的制備及其抗氧化性的研究[J];上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào);2010年03期

7 江敏;;氨基葡萄糖的藥理學(xué)研究進(jìn)展[J];中國(guó)藥房;2010年17期

8 袁靜;孟笑;何冰芳;;以惡臭假單胞菌發(fā)酵制備D-氨基葡萄糖酸[J];過(guò)程工程學(xué)報(bào);2009年01期

9 趙廣凱;楊思舉;趙永德;;D-氨基葡萄糖的化學(xué)修飾研究進(jìn)展[J];河南科學(xué);2008年08期

10 袁春桃;成奮民;郭振楚;;D-氨基葡萄糖及其衍生物金屬配合物的研究進(jìn)展[J];化工技術(shù)與開(kāi)發(fā);2007年02期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 楊艷;劉萬(wàn)順;韓寶芹;劉寧;;氨基葡萄糖抗炎功能的研究[A];華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)2008年學(xué)術(shù)交流會(huì)論文摘要匯編[C];2008年

2 杜予民;;氨基葡萄糖的功能及研究進(jìn)展[A];《植物化學(xué)物及膳食補(bǔ)充劑的研究進(jìn)展》專(zhuān)家高層論壇會(huì)議資料[C];2011年

3 王秀香;;氨基葡萄糖治療骨關(guān)節(jié)病的療效觀察[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第八次全國(guó)老年醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2007年

4 黃玉生;牛建偉;;氨基葡萄糖的骨關(guān)節(jié)保健作用[A];中國(guó)骨傷人才研究會(huì)建會(huì)二十周年、全國(guó)高等中醫(yī)院校骨傷教育研究會(huì)建會(huì)三十周年、宋一同教授行醫(yī)六十周年慶典大會(huì)暨兩會(huì)表彰大會(huì)及換屆工作會(huì)議論文集[C];2013年

5 鮑晶晶;朱麗英;黃和;江凌;;多酶偶聯(lián)催化甲殼素制備功能性糖氨基葡萄糖[A];中國(guó)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)第十五屆年會(huì)論文摘要集[C];2018年

6 李明潤(rùn);高向耘;李明;關(guān)俊玲;王英;單淇;廖楠;;低分子肝素鈣總糖、葡萄糖醇酸、氨基葡萄糖和硫酸根含量分析[A];第八屆全國(guó)復(fù)合糖生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要論文集[C];2004年

7 歐陽(yáng)捷;許晨;葉劍良;陳忠;;利用1D TOCSY技術(shù)研究氨基葡萄糖水溶液結(jié)構(gòu)[A];第十七屆全國(guó)波譜學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2012年

8 王娟;劉祥;梁宇和;李蘭芬;蘇曉東;;人類(lèi)6-磷酸氨基葡萄糖乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)和功能的研究[A];中國(guó)晶體學(xué)會(huì)第四屆全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)會(huì)議學(xué)術(shù)論文摘要集[C];2008年

9 孟笑;袁靜;何冰芳;;高產(chǎn)氨基葡萄糖酸菌株的篩選及培養(yǎng)基優(yōu)化[A];第三屆全國(guó)化學(xué)工程與生物化工年會(huì)論文摘要集（上）[C];2006年

10 付辰煒;劉萬(wàn)順;韓寶芹;楊艷;劉冰;;氨基葡萄糖對(duì)小鼠免疫功能的影響[A];中國(guó)老年學(xué)學(xué)會(huì)2006年老年學(xué)學(xué)術(shù)高峰論壇論文集[C];2006年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 北京醫(yī)院藥學(xué)部主任藥師 劉治軍;用氨基葡萄糖有些問(wèn)題要注意[N];健康報(bào);2015年

2 本報(bào)特約撰稿 徐錚奎;氨基葡萄糖內(nèi)需待擴(kuò)[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2014年

3 特約撰稿 徐錚奎;我國(guó)氨基葡萄糖市場(chǎng)：未墾的沃土[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2010年

4 張建琛;全球首個(gè)高純硫酸氨基葡萄糖生產(chǎn)基地建成[N];科技日?qǐng)?bào);2008年

5 徐錚奎;氨基葡萄糖藥理研究新進(jìn)展[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2001年

6 徐錚奎;我國(guó)氨基葡萄糖類(lèi)保健食品發(fā)展?jié)摿薮骩N];中國(guó)食品質(zhì)量報(bào);2010年

7 曉艷;氨基葡萄糖治療骨關(guān)節(jié)炎引爭(zhēng)議[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2004年

8 本報(bào)特約撰稿人 徐錚奎;抗關(guān)節(jié)炎藥物海風(fēng)吹拂[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2008年

9 北京醫(yī)院藥學(xué)部主任藥師 劉治軍;對(duì)付骨關(guān)節(jié)炎 試試氨基葡萄糖[N];健康報(bào);2015年

10 上海復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院主任藥師 李中東;氨基葡萄糖是骨關(guān)節(jié)炎長(zhǎng)期治療的“神器”嗎(上)[N];家庭醫(yī)生報(bào);2019年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 顧文秀;氨基葡萄糖酸的合成與絡(luò)合性質(zhì)研究[D];江南大學(xué);2008年

2 張莉;殼寡糖、氨基葡萄糖及其衍生物的制備和抗腫瘤活性研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2005年

3 楊艷;殼寡糖，氨基葡萄糖及其衍生物的抗氧化功能研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2005年

4 任群翔;氨基葡萄糖/殼寡糖稀土配合物的合成、表征及抗氧化性能研究[D];東北大學(xué);2009年

5 陳欣;代謝工程改造大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)氨基葡萄糖及過(guò)程優(yōu)化與控制[D];江南大學(xué);2012年

6 王昕;非甾體抗炎藥聯(lián)合氨基葡萄糖及關(guān)節(jié)鏡手術(shù)治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的臨床研究[D];蘭州大學(xué);2013年

7 索海瑞;負(fù)載氨基葡萄糖的光交聯(lián)明膠水凝膠性質(zhì)研究[D];浙江大學(xué);2015年

8 楊鑫;PCV2體外培養(yǎng)特性的研究及HMGCR對(duì)PCV2復(fù)制的影響[D];吉林大學(xué);2015年

9 滕大勇;氨基糖類(lèi)衍生物智能水凝膠作為藥物載體的研究[D];南開(kāi)大學(xué);2009年

10 周樂(lè);聯(lián)合近紅外熒光分子腫瘤靶向探針的熱效應(yīng)與免疫因子協(xié)同治療甲狀腺腫瘤的研究[D];吉林大學(xué);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 溫朝;GlmS酶活力改造及對(duì)大腸桿菌產(chǎn)氨基葡萄糖的影響研究[D];齊魯工業(yè)大學(xué);2019年

2 董瑞真;大腸桿菌代謝途徑的改造對(duì)氨基葡萄糖積累的影響[D];齊魯工業(yè)大學(xué);2018年

3 鄭星麗;傲復(fù)力膠囊市場(chǎng)營(yíng)銷(xiāo)策略改進(jìn)研究[D];海南大學(xué);2017年

4 張強(qiáng);含氨基葡萄糖單元的脲類(lèi)衍生物合成與抑菌活性測(cè)定[D];中國(guó)礦業(yè)大學(xué);2014年

5 邱從平;固定化酶法合成氨基葡萄糖-6-磷酸的研究[D];浙江工業(yè)大學(xué);2011年

6 肖靜靜;氨基葡萄糖的氧化研究[D];江南大學(xué);2012年

7 田亞琴;脂肪酰化、羥烷化氨基葡萄糖表面活性劑的制備及其性能研究[D];青島科技大學(xué);2010年

8 趙廣凱;D-氨基葡萄糖含磷衍生物的合成與結(jié)構(gòu)表征[D];河南大學(xué);2009年

9 賀小玲;氨基葡萄糖擬肽類(lèi)物質(zhì)的制備及檢測(cè)方法的建立[D];集美大學(xué);2015年

10 侯思潤(rùn);膽酸改性氨基葡萄糖衍生物的合成及生物學(xué)評(píng)價(jià)研究[D];華南理工大學(xué);2014年

，

本文編號(hào)：2671609