【摘要】：輔酶Q10是有氧呼吸電子傳遞鏈上一個(gè)必需的輔助因子,由苯醌環(huán)和一個(gè)疏水性的類異戊二烯鏈共軛組成。由于其對(duì)多種疾病的治療具有顯著效果,發(fā)酵法生產(chǎn)輔酶Q10受到許多研究者的青睞。類球紅細(xì)菌作為天然的高產(chǎn)輔酶Q10菌株,受到了眾多研究者的追捧。由于其遺傳操作體系復(fù)雜,該菌株的研究主要還集中在發(fā)酵工藝的優(yōu)化和傳統(tǒng)的誘變育種上。本研究以高產(chǎn)輔酶Q10的工業(yè)生產(chǎn)菌株類球紅細(xì)菌Rhodobacte sphaeroides GY-2為研究對(duì)象,對(duì)其遺傳操作體系進(jìn)行了探究,成功地開(kāi)發(fā)了該菌株基因組無(wú)痕編輯工具。本研究不僅有助于通過(guò)代謝途徑的調(diào)控提高類球紅細(xì)菌輔酶Q10的產(chǎn)量,同時(shí)也為改造類球紅細(xì)菌生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品的研究提供了新的思路,具有重要的理論意義與實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。1、敲除了類球紅細(xì)菌R.sphaeroides GY-2的upp基因。利用改造后的自殺性質(zhì)粒,敲除了類球紅細(xì)菌R.sphaeroides GY-2的upp基因,獲得了生產(chǎn)輔酶Q10新的基盤(pán)細(xì)胞R.sphaeroides GY-2 △upp。該菌株對(duì)5-FU不敏感,其生長(zhǎng)、細(xì)胞干重、輔酶Q10產(chǎn)量與工業(yè)菌株無(wú)顯著差異,回補(bǔ)了谷氨酸棒桿菌的upp基因后,又恢復(fù)了對(duì)5-FU敏感性。2、建立了以自殺性質(zhì)粒pSUP202介導(dǎo)基于upp反向篩選標(biāo)記的基因組無(wú)痕編輯工具。利用此工具,成功地敲除了編碼分支酸變位酶的Cm基因,得到了雙基因敲除菌株R.sphaeroidesGY-2 △upp△Cm。與出發(fā)菌株相比,R.sphaeroides GY-2△upp△Cm菌株輔酶Q10產(chǎn)量提高了 15.3%,輔酶Q10的產(chǎn)率提高了20.4%,生物量無(wú)明顯變化。同時(shí)檢測(cè)到R.sphaeroidesGY-2 △uppACm菌株發(fā)酵液上清中積累了0.5mM的pHBA。3、利用建立的基因編輯方法,獲得了R.Shaeroides GY-2 △upp-crtA::ubiG和R.Sphaeroides GY-2△upp-crtD::ubiE的突變菌株。R.Sphaeroides GY-2 △upp-crtA::ubiG重組菌株的輔酶Q10產(chǎn)量相比出發(fā)菌株R.Sphaeroides GY-2 Aupp提高了 11.39%,輔酶Q10的產(chǎn)率提高了 13.1%,生物量無(wú)明顯變化。而R.Sphaeroides GY-2△upp-crtD::ubiE重組菌株相比出發(fā)菌株R.Sphaeroides GY-2△upp輔酶Q10產(chǎn)量,輔酶Q10的產(chǎn)率和生物量均無(wú)明顯變化。
【圖文】：

３類球紅細(xì)菌中輔酶Ｑ１０的生物合成途徑逡逑輔酶Ｑ１０的生物合成途徑主要有三部分組成：苯醌環(huán)的合成、多聚異戊二烯焦逡逑磷酸側(cè)鏈的合成以及苯醌環(huán)的修飾［２】（見(jiàn)圖２）。在真核生物與原核生物中苯醌環(huán)的逡逑來(lái)源途徑不同。在原核生物內(nèi)醌環(huán)的前體是對(duì)羥基苯甲酸，對(duì)羥基苯甲酸是由莽草逡逑酸途徑產(chǎn)生的。莽草酸途徑產(chǎn)生的分支酸是原核生物合成芳香族氨基酸的重要中間逡逑物，其中產(chǎn)生的分支酸經(jīng)ｗＷＣ基因編碼的分支酸丙酮酸裂解酶催化生成對(duì)羥基苯甲逡逑酸。而大部分的真核生物內(nèi)是沒(méi)有莽草酸途徑的，這就必須依靠生物體內(nèi)的必需氨逡逑基酸酪氨酸來(lái)合成苯醌環(huán)。釀酒酵母作為低等真菌，其對(duì)羥基苯甲酸可由莽草酸途逡逑徑和酪氨酸兩種方式合成。此外，所有的多聚異戊二烯焦磷酸側(cè)鏈都是由兩個(gè)重要逡逑的五碳化合物，異戊烯焦磷酸（ＩＰＰ）和其同分異構(gòu)體二甲基丙烯基焦磷酸（ＤＭＡＰＰ）逡逑組成的。不同的生物體內(nèi)ＩＰＰ和ＤＭＡＰＰ的合成途徑不同，在真細(xì)菌、綠藻和植物逡逑的葉綠體中

類球紅細(xì)菌中苯醌環(huán)的前體物質(zhì)為對(duì)羥基苯甲酸，，首先由莽草酸途徑產(chǎn)生的分逡逑支酸經(jīng)基因編碼的分支酸丙酮酸裂解酶催化形成對(duì)羥基苯甲酸，然后再進(jìn)一步逡逑異戊烯化以及對(duì)苯醌環(huán)的修飾（圖３）。莽草酸途徑作為芳香族氨基酸合成的關(guān)鍵逡逑途徑，其中間產(chǎn)物分支酸一方面經(jīng)分支酸丙酮酸裂解酶催化形成對(duì)羥基苯甲酸；逡逑方面由分支酸變位酶（Ｃｍ）催化形成預(yù)苯酸
【學(xué)位授予單位】：福建師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：TQ920.6

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本文編號(hào)：2658209