【摘要】：輔酶Q10是有氧呼吸電子傳遞鏈上一個必需的輔助因子,由苯醌環(huán)和一個疏水性的類異戊二烯鏈共軛組成。由于其對多種疾病的治療具有顯著效果,發(fā)酵法生產輔酶Q10受到許多研究者的青睞。類球紅細菌作為天然的高產輔酶Q10菌株,受到了眾多研究者的追捧。由于其遺傳操作體系復雜,該菌株的研究主要還集中在發(fā)酵工藝的優(yōu)化和傳統(tǒng)的誘變育種上。本研究以高產輔酶Q10的工業(yè)生產菌株類球紅細菌Rhodobacte sphaeroides GY-2為研究對象,對其遺傳操作體系進行了探究,成功地開發(fā)了該菌株基因組無痕編輯工具。本研究不僅有助于通過代謝途徑的調控提高類球紅細菌輔酶Q10的產量,同時也為改造類球紅細菌生產高附加值產品的研究提供了新的思路,具有重要的理論意義與實際應用價值。1、敲除了類球紅細菌R.sphaeroides GY-2的upp基因。利用改造后的自殺性質粒,敲除了類球紅細菌R.sphaeroides GY-2的upp基因,獲得了生產輔酶Q10新的基盤細胞R.sphaeroides GY-2 △upp。該菌株對5-FU不敏感,其生長、細胞干重、輔酶Q10產量與工業(yè)菌株無顯著差異,回補了谷氨酸棒桿菌的upp基因后,又恢復了對5-FU敏感性。2、建立了以自殺性質粒pSUP202介導基于upp反向篩選標記的基因組無痕編輯工具。利用此工具,成功地敲除了編碼分支酸變位酶的Cm基因,得到了雙基因敲除菌株R.sphaeroidesGY-2 △upp△Cm。與出發(fā)菌株相比,R.sphaeroides GY-2△upp△Cm菌株輔酶Q10產量提高了 15.3%,輔酶Q10的產率提高了20.4%,生物量無明顯變化。同時檢測到R.sphaeroidesGY-2 △uppACm菌株發(fā)酵液上清中積累了0.5mM的pHBA。3、利用建立的基因編輯方法,獲得了R.Shaeroides GY-2 △upp-crtA::ubiG和R.Sphaeroides GY-2△upp-crtD::ubiE的突變菌株。R.Sphaeroides GY-2 △upp-crtA::ubiG重組菌株的輔酶Q10產量相比出發(fā)菌株R.Sphaeroides GY-2 Aupp提高了 11.39%,輔酶Q10的產率提高了 13.1%,生物量無明顯變化。而R.Sphaeroides GY-2△upp-crtD::ubiE重組菌株相比出發(fā)菌株R.Sphaeroides GY-2△upp輔酶Q10產量,輔酶Q10的產率和生物量均無明顯變化。
【圖文】：

３類球紅細菌中輔酶Ｑ１０的生物合成途徑逡逑輔酶Ｑ１０的生物合成途徑主要有三部分組成：苯醌環(huán)的合成、多聚異戊二烯焦逡逑磷酸側鏈的合成以及苯醌環(huán)的修飾［２】（見圖２）。在真核生物與原核生物中苯醌環(huán)的逡逑來源途徑不同。在原核生物內醌環(huán)的前體是對羥基苯甲酸，對羥基苯甲酸是由莽草逡逑酸途徑產生的。莽草酸途徑產生的分支酸是原核生物合成芳香族氨基酸的重要中間逡逑物，其中產生的分支酸經ｗＷＣ基因編碼的分支酸丙酮酸裂解酶催化生成對羥基苯甲逡逑酸。而大部分的真核生物內是沒有莽草酸途徑的，這就必須依靠生物體內的必需氨逡逑基酸酪氨酸來合成苯醌環(huán)。釀酒酵母作為低等真菌，其對羥基苯甲酸可由莽草酸途逡逑徑和酪氨酸兩種方式合成。此外，所有的多聚異戊二烯焦磷酸側鏈都是由兩個重要逡逑的五碳化合物，異戊烯焦磷酸（ＩＰＰ）和其同分異構體二甲基丙烯基焦磷酸（ＤＭＡＰＰ）逡逑組成的。不同的生物體內ＩＰＰ和ＤＭＡＰＰ的合成途徑不同，在真細菌、綠藻和植物逡逑的葉綠體中

類球紅細菌中苯醌環(huán)的前體物質為對羥基苯甲酸，，首先由莽草酸途徑產生的分逡逑支酸經基因編碼的分支酸丙酮酸裂解酶催化形成對羥基苯甲酸，然后再進一步逡逑異戊烯化以及對苯醌環(huán)的修飾（圖３）。莽草酸途徑作為芳香族氨基酸合成的關鍵逡逑途徑，其中間產物分支酸一方面經分支酸丙酮酸裂解酶催化形成對羥基苯甲酸；逡逑方面由分支酸變位酶（Ｃｍ）催化形成預苯酸
【學位授予單位】：福建師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：TQ920.6

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本文編號：2658209