【摘要】：硬葡聚糖(Scleroglucan)是絲狀真菌中小核菌屬合成分泌的微生物多糖,其中以齊整小核菌最為典型。為進(jìn)一步提高硬葡聚糖產(chǎn)量,降低硬葡聚糖的生產(chǎn)成本,以本研究室獲得的一株野生型齊整小核菌菌株(Sclerotium rolfsii WSH-G01)為研究對(duì)象。在搖瓶水平上對(duì)培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件進(jìn)行單因素優(yōu)化,結(jié)合響應(yīng)面分析得到最適發(fā)酵培養(yǎng)基組成及發(fā)酵培養(yǎng)條件,在3 L發(fā)酵罐上對(duì)硬葡聚糖分批發(fā)酵過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)成分和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。最后對(duì)硬葡聚糖的理化性質(zhì)和水解條件進(jìn)行初步分析。本文主要研究?jī)?nèi)容如下:(1)通過(guò)測(cè)定生長(zhǎng)曲線確定該齊整小核菌的最佳接種種齡為72 h。單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析優(yōu)化了培養(yǎng)基中的關(guān)鍵因子(葡萄糖、酵母膏、NaNO_3、培養(yǎng)時(shí)間)對(duì)硬葡聚糖積累的影響。獲得最適發(fā)酵培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件:葡萄糖55.0 g·L~(-1),酵母膏0.5g·L~(-1),NaNO_3 2.5 g·L~(-1),培養(yǎng)時(shí)間5 d,初始pH 4.0,接種量5%,250 m L搖瓶裝液量50mL。在30℃,220 r·min~(-1)條件下培養(yǎng)120 h,硬葡聚糖產(chǎn)量11.8 g·L~(-1)。(2)在3 L發(fā)酵罐上對(duì)初始葡萄糖濃度(35 g·L~(-1)、55 g·L~(-1)、75 g·L~(-1)、95 g·L~(-1)),攪拌轉(zhuǎn)速(200 r·min~(-1)、400 r·min~(-1)、600 r·min~(-1)),通氣量(0.5 vvm、1 vvm、2 vvm、3 vvm)和補(bǔ)料發(fā)酵策略(一次性、恒速流加、恒定濃度補(bǔ)料)進(jìn)行優(yōu)化。確定最適的初始葡萄糖濃度為75 g·L~(-1),攪拌轉(zhuǎn)速400 r·min~(-1),通氣1 vvm,最佳補(bǔ)料策略為發(fā)酵40 h將葡萄糖濃度恒定在65 g·L~(-1)補(bǔ)料32 h,在此最優(yōu)條件下硬葡聚糖產(chǎn)量最高達(dá)到34.5 g·L~(-1),細(xì)胞干重達(dá)到20.7 g·L~(-1),生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到0.48 g·L~(-1)·h~(-1),底物利用率為30%。(3)初步分析冷凍干燥獲得的多糖樣品,研究了多糖純度和多糖結(jié)構(gòu)。確定硬葡聚糖為純度96.2%,由葡萄糖分子組成,重均分子量在1.9×10~7 Da的β-葡聚糖。在此基礎(chǔ)上,研究了酸水解和β-1,3葡聚糖酶水解硬葡聚糖后的分子量分布。0.1 M HCl酸水解后多糖的重均分子量分布為65185、5048、1061、217 Da。構(gòu)建四個(gè)不同來(lái)源的β-1,3葡聚糖酶基因BGLM,PGLA,EXG1,BGLF表達(dá)載體誘導(dǎo)獲得粗酶液水解硬葡聚糖,水解溫度為37℃時(shí)硬葡聚糖水解重均分子量為20 kDa左右,30℃時(shí)水解重均分子量為200 kDa左右。
【圖文】：

江南大學(xué)碩士學(xué)位論文(1) 細(xì)胞內(nèi)多糖，用于儲(chǔ)存細(xì)胞的碳或能量；(2) 結(jié)構(gòu)性多糖，是組成部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)或細(xì)胞壁的組成部分；(3) 胞外多糖，屬于微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物，是重要的致病因子，其功能主要包括 1) 有利于菌體吸附寄主和吸收營(yíng)養(yǎng)；2) 有助于菌體抵御干燥的損害。微生物發(fā)酵法能產(chǎn)生大量的微生物多糖，這些胞外多糖可以從發(fā)酵液中回收，具有較大商業(yè)化潛力。在微生物系統(tǒng)遵循多糖的生產(chǎn)的一般途徑，硬葡聚糖生物合成被假定為有三個(gè)步驟：(1) 底物攝取，(2) 細(xì)胞內(nèi)形成，(3) 分泌到胞外[31]。小核菌硬葡聚糖生物合成途徑遵循一般的葡萄糖基胞外多糖的合成代謝途徑：胞外葡萄糖被葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白吸收并通過(guò)己糖激酶(1) 磷酸化反應(yīng)行成葡萄糖-6-磷酸；葡萄糖-6-磷酸在磷酸葡萄糖變位酶(2) 作用下異構(gòu)化成葡萄糖-1-磷酸；葡萄糖-1-磷酸經(jīng) UTP 葡萄糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶(3) 作用形成UDP-葡萄糖；β-1,3-D-葡聚糖合酶(4) 以UDP-葡萄糖作為底物形成β-1,3-D-葡聚糖。最后，糖基轉(zhuǎn)移酶/葡糖苷酶(5) 將含有 β-1,6 鍵連接的葡糖基連接到以 β-1,3 鍵連接的主鏈上[20]。

江南大學(xué)碩士學(xué)位論文程液 5 mL 加入兩個(gè)相同試管中，取 5 mL 0以 0.2MNaOH 溶液為對(duì)照，30°C 和 37°C PC 測(cè)定分子量分布。糖含量糖在硫酸的作用下先水解成單糖，并迅色化合物，再以比色法測(cè)定[69]。葡萄糖標(biāo)7X-0.03842，R2=0.995，，表明葡萄糖含量。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：TQ929.2

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本文編號(hào)：2656450