發(fā)布時間：2020-05-09 15:45

【摘要】：尿酸氧化酶(Urate oxidase,UOX)在嘌呤代謝路徑中起到重要作用,它能夠氧化尿酸生成尿囊素,尿囊素在水中的溶解度是尿酸的5-10倍,能夠大大降低生物體內(nèi)尿酸的含量。在大部分生物、微生物中,都有尿酸氧化酶存在,然而人、猿等靈長類等動物的尿酸氧化酶基因在進化過程中發(fā)生突變,使機體缺乏有生物活性的尿酸氧化酶基因,而使尿酸成為人體內(nèi)嘌呤代謝的終產(chǎn)物。然而體內(nèi)尿酸濃度長期處于過高的水平就會引發(fā)人體內(nèi)高尿酸血癥并加劇很多疾病,如痛風、心血管疾病及腎臟疾病等。尿酸氧化酶可以用于臨床治療,腎臟對尿囊素具有高效的排泄能力,從而減少高尿酸血癥對人體的損傷以及并發(fā)癥。尿酸氧化酶還可以利用尿酸氧化酶-過氧化物酶偶聯(lián)法測定血尿酸含量。但其產(chǎn)酶能力和耐熱性仍制約著尿酸氧化酶的廣泛使用。本研究的主要內(nèi)容如下:1.利用液氮凍融法,將細胞凍結(jié)后再融化,增加細胞的通透性,建立胞內(nèi)尿酸氧化酶快速提取方法。相比常用的超聲波破碎法每次只能提取一個樣品,此方法可以對多個樣品進行同時提取。超聲波破碎提取時間為30 min,液氮凍融法提取時間為1 min,提取時間大大縮短。且提取量小,符合快速篩選中樣品量小的要求。利用尿酸氧化酶-過氧化物酶偶聯(lián)法測定血尿酸含量進行快速篩選。相比常規(guī)方法,該方法通過生成紅色醌亞胺的量測定酶活,呈色深淺反映尿酸濃度高低,更為直觀。進行相對酶活的一致性驗證,證明了快速提取方法和快速檢測法對于篩選的有效性,可用于尿酸氧化酶高通量篩選。2.通過透明圈法進行初篩,再利用高通量篩選法篩選出具有耐熱性質(zhì)的尿酸氧化酶。從132株酵母中篩選出產(chǎn)耐熱尿酸氧化酶的菌株CU1。再將該菌株作為出發(fā)菌,從利用254 nm的紫外線對菌株進行誘變得到菌株CUM09。出發(fā)菌株經(jīng)70℃處理30 min后保留86.01%酶活性,CUM09的菌株經(jīng)70℃處理30 min后保留88.89%酶活性。該熱處理條件下,CUM09產(chǎn)尿酸氧化酶酶活性比原始菌株提高了2.88%。3.對產(chǎn)朊假絲酵母菌株CUM09進行產(chǎn)酶條件優(yōu)化,通過單因素實驗及正交實驗,確定最佳產(chǎn)酶條件為發(fā)酵溫度28℃,pH8.5,接種量為2.5%,以麥芽汁為碳源氮源培養(yǎng)條件下,利用尿酸作為底物,培養(yǎng)16 h產(chǎn)酶量達到最大,酶活為1249.50 U/mL,比初始條件提高了56.58%。4.研究了產(chǎn)朊假絲酵母CUM09尿酸氧化酶的酶學性質(zhì),探討了酶的最適反應溫度、酶的最適反應pH、米氏常數(shù)K_m值以及酶對溫度的熱穩(wěn)定性。其最適溫度為40℃,最適pH為8.5,米氏常數(shù)K_m值為36.1μmol/L。70℃下保溫30 min,酶活力保持80%以上。
【圖文】：

圖 1-1 尿酸生成的途徑Figure 1-1. The production of Uric acid分生物、微生物中，尿酸可進一步由尿酸氧化酶氧化，但人的尿酸氧化酶基因在進化過程中發(fā)生突變，使機體缺乏有生基因，而使尿酸成為人體內(nèi)嘌呤代謝的終產(chǎn)物。這在進化上人體內(nèi)具有較強的抗氧化作用，能清除血漿中約 2/3 的自由苷等重要物質(zhì)受到損害；高尿酸通過激活腎素、血管緊張素血管收縮，，血壓升高，增加腦供血，使得人類在直立行走狀的代謝排泄主要是隨尿液排出。當血液循環(huán)流入腎小球時，血液中小球濾過，其中大部分被近端腎小管重吸收，然后又由遠曲經(jīng)尿液排出的尿酸占 70%。在正常狀態(tài)下，體內(nèi)尿酸總池為 濃度取決于尿酸生成速度和經(jīng)腎排出速度[2]。因此腎臟是排

產(chǎn)耐熱尿酸氧化酶菌株的篩選、產(chǎn)酶優(yōu)化與酶學性質(zhì)研究與辣根過氧化物酶共固定化于生物芯片上，當加入血清樣品和底物尿酸被尿酸氧化酶催化生成過氧化氫，過氧化氫與底物中的二氯羥HBS）、4-氨基安替比林（4-APP）一同在辣根過氧化物酶的催化下生胺，醌亞胺在 500nm 處有吸收，呈色深淺反映尿酸濃度高低，經(jīng)計含量[25]。玉金等經(jīng)過實驗研究，成功研制了以 2，4，6-三溴-3-羥基苯甲酸（T測定血清尿酸試劑。如圖 1-3 所示[26]，尿酸被尿酸氧化酶催化生成氧化氫和 4-氨基安替比林（4-APP）以及色原 TBHBA 在過氧化酶的色的醌亞胺物質(zhì)，紅色醌亞胺的濃度和尿酸氧化酶的含量成正比，0 或顏色判斷其尿酸氧化酶酶活的高低。此法特異性強，靈敏度明顯因而目前臨床檢驗大多使用此方法測定血清尿酸。
【學位授予單位】：浙江工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TQ925

【參考文獻】

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本文編號：2656371