【摘要】：林蛙,在我國(guó)主要分布在東北三省,是一類十分有名的蛙科,它具有很高的價(jià)值,主要是食補(bǔ)、保健、美容以及經(jīng)濟(jì)藥用價(jià)值等。但是,目前在市場(chǎng)上林蛙的加工利用度極低,導(dǎo)致以林蛙為原料的產(chǎn)業(yè),如飲食業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)、保健品等行業(yè)產(chǎn)品的開發(fā)和生產(chǎn)嚴(yán)重滯后,造成目前市場(chǎng)上銷售的林蛙產(chǎn)品仍以林蛙油制品為主。林蛙油只占雌蛙的15%左右,其余約85%的雌蛙骨肉殘?bào)w和全部的雄蛙都無(wú)法得到有效的利用,它們只有部分作為動(dòng)物飼料,絕大部分作為廢棄物丟棄,造成了資源的極大浪費(fèi)和環(huán)境的嚴(yán)重污染。因此,本實(shí)驗(yàn)以東北特有的林蛙骨肉為原料,以水解度和多肽得率為指標(biāo),進(jìn)行林蛙骨肉酶解工藝的優(yōu)化;再以螯合率為指標(biāo),優(yōu)化酶解液與CaCl_2的螯合工藝;接下來設(shè)計(jì)Caco-2細(xì)胞模型,從細(xì)胞學(xué)角度探討林蛙骨肉多肽螯合鈣相對(duì)其他補(bǔ)鈣劑的吸收特點(diǎn);最后為制成林蛙骨肉的相關(guān)產(chǎn)品,以綜合評(píng)分為指標(biāo),優(yōu)化螯合鈣片劑的配方工藝。主要的研究結(jié)果如下:(1)林蛙骨肉酶解工藝的研究:以水解度和多肽得率為指標(biāo),分別以堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶這5種酶,在一定條件下制備林蛙骨肉多肽液,最終確定胰蛋白酶的水解效果最好,水解度18.77±0.374%,多肽得率34.66±0.348%�？疾焖鈺r(shí)間、水解溫度、加酶量、pH,對(duì)林蛙骨肉多肽水解效果的影響,利用L_9(3~4)正交試驗(yàn)對(duì)林蛙骨肉多肽的提取條件進(jìn)行優(yōu)化,最優(yōu)酶解條件為:加酶量5000 U/g,pH值8,溫度45℃,時(shí)間4 h,此時(shí)的水解度為21.34±0.017%,多肽得率40.11±0.043%。在最優(yōu)工藝下,制得林蛙骨肉多肽液。把多肽液制成凍干粉,檢測(cè)凍干粉的理化性質(zhì),結(jié)果顯示,在210 nm處有多肽的紫外特征吸收峰,通過傅里葉紅外光譜檢測(cè),在1538 cm~(-1)處有多肽的特征官能團(tuán),表明成功制備出了林蛙骨肉多肽粉。(2)林蛙骨多肽螯合鈣的制備及表征:以林蛙骨肉多肽液和CaCl_2為原料,在一定條件下制備多肽螯合鈣,以螯合率為指標(biāo),考察螯合溫度、時(shí)間、肽鈣比、無(wú)水乙醇添加倍數(shù)這四個(gè)因素對(duì)螯合率的影響。采用單因素響應(yīng)面試驗(yàn)研究分析,從而可以確定最優(yōu)的工藝,螯合條件為:時(shí)間為30 min,溫度為30℃,肽鈣比(多肽液的體積與加入氯化鈣質(zhì)量的比值)為10:1(ml/g),無(wú)水乙醇的添加倍數(shù)為8,螯合率達(dá)到79.43±0.065%。將制得的多肽螯合鈣結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,分析方法采用紫外光譜、傅里葉紅外光譜、掃描電鏡,從而推測(cè)了多肽螯合鈣的結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示,利用紫外、紅外光譜進(jìn)行分析后,能夠明顯的看出多肽和螯合鈣在化學(xué)結(jié)構(gòu)上發(fā)生一定的變化;利用掃描電鏡分析后,可以清晰的看到較多“白色晶體”鑲嵌在多肽螯合鈣表面。以上結(jié)果均表明了多肽與鈣形成了新的螯合物。(3)林蛙骨肉多肽螯合鈣吸收特性的研究:采用Caco-2細(xì)胞模型,通過MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率,從而構(gòu)建細(xì)胞模型。再以CaCl_2,葡萄糖酸鈣,CCP-Ca為對(duì)照組,從細(xì)胞學(xué)角度探討和了解林蛙骨肉多肽螯合鈣相對(duì)其他補(bǔ)鈣劑的吸收特點(diǎn)。林蛙骨肉多肽螯合鈣會(huì)對(duì)細(xì)胞的存活產(chǎn)生一定的影響,加入過量會(huì)影響細(xì)胞的存活,當(dāng)林蛙骨肉多肽螯合鈣的加入量高于0.5 mg/ml時(shí),細(xì)胞的存活率顯著降低。林蛙骨肉多肽螯合鈣與CCP-Ca在細(xì)胞的吸收方面效果相似,并且優(yōu)于CaCl_2和葡萄糖酸鈣。(4)林蛙骨肉螯合鈣片劑的制備工藝:采用濕法造粒進(jìn)行林蛙骨肉多肽螯合鈣片劑的制備。結(jié)果選定的林蛙骨肉多肽螯合鈣片劑的輔料為:填充劑為微晶纖維素,矯味劑為山梨糖醇,酸味劑為蘋果酸。以片劑的綜合評(píng)分為指標(biāo),通過單因素響應(yīng)面試驗(yàn)得出片劑輔料的最佳配方為:填充劑(微晶纖維素)的添加量為30%,矯味劑(山梨糖醇)的添加量為45%,酸味劑(蘋果酸)的添加量為5%。片劑制備中添加的其他配方為:崩解劑(交聯(lián)羧甲基纖維素鈉)的添加量為7%,潤(rùn)滑劑(硬脂酸鎂)的添加量為3%,林蛙骨肉多肽螯合鈣的添加量為20%。得到的片劑外觀為圓狀,表面光滑,乳白色,色澤均勻;口感上無(wú)腥味,奶香適宜,酸甜可口,軟硬適中,沒有顆粒感。
【圖文】：

使它們均勻混合好，靜置 30 min 后，取上清液于 540 nm 處測(cè) OD 值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖2.1。圖 2.1 多肽標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 2.1 Peptide standard curve

圖 2.2 林蛙骨肉粉營(yíng)養(yǎng)成分分析圖Fig 2.2 Rana bone flesh nutrient composition analysis蛋白酶的篩選解法便于控制且條件溫和，由于蛋白酶具有專一性和選擇性，可以條件制備出肽。以水解度和多肽得率為指標(biāo)，使用 5 種蛋白酶酶解 2.3 所示，可以看出在胰蛋白酶水解條件下，水解度為 18.77±0.37為 34.66±0.348%，能同時(shí)達(dá)到最高，，因此選用胰蛋白酶為最佳的林解酶。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TQ460.1;TS201.4

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本文編號(hào)：2652236