【摘要】：化石燃料的儲備量急劇下降,溫室效應日益加劇,清潔能源纖維素乙醇成為各國的研究熱點。纖維素乙醇以木質(zhì)纖維素為原料,木質(zhì)纖維素預處理產(chǎn)生的抑制物尤其是糠醛會嚴重抑制菌株的生長和產(chǎn)醇。運動發(fā)酵單胞菌因其具有眾多良好的特性成為生產(chǎn)乙醇的優(yōu)勢菌株,但是其生長和產(chǎn)醇也會受到糠醛的嚴重抑制,因此,獲得具有糠醛耐受性的運動發(fā)酵單胞菌對工業(yè)乙醇的生產(chǎn)有著重要的意義。本次研究以運動發(fā)酵單胞菌CP4為出發(fā)菌種,首次嘗試易錯PCR全基因組改組技術改造該菌種,獲得了糠醛耐受突變體F211和F27。3 g/L糠醛脅迫下,突變體F211和F27的最大細胞密度比CP4高140-149%,且達到最大細胞密度所需的時間比CP4快約16 h,突變體的乙醇得率比CP4高115-118%,并且突變體具有穩(wěn)定遺傳的糠醛耐受性。在2 g/L和3 g/L糠醛條件下,突變體F211和F27生長和發(fā)酵均快于出發(fā)菌株CP4,1 g/L糠醛為抑制菌株生長和發(fā)酵的最小濃度。葡萄糖濃度為15-20%(w/v)的培養(yǎng)基中,突變體F211和F27的生長和產(chǎn)醇速率顯著快于出發(fā)菌株,說明糠醛耐受突變體同時具有高濃度葡萄糖糖耐受性。突變體的糠醛還原酶活性顯著高于出發(fā)菌株CP4,說明突變體通過加速糠醛還原而提高其糠醛耐受性。重測序表明突變體F211和F27分別有12和13個位點發(fā)生突變。突變基因功能的初步研究表明轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因缺失菌株CP4-△1431糠醛耐受性和糠醛還原酶活性均提高;外排轉(zhuǎn)運蛋白基因缺失菌株CP4-△0525糠醛耐受性降低。上述結果表明突變體F211和F27可能通過調(diào)節(jié)糠醛還原酶基因的表達,加速糠醛的還原和外排來提高菌株的耐受性。綜上所述,首次使用易錯PCR全基因組改組技術改造運動發(fā)酵單胞菌,并獲得了耐受糠醛、且遺傳穩(wěn)定的突變菌株,為運用該技術快速高效改善運動發(fā)酵單胞菌對纖維素水解液抑制物的耐受性提供了基礎。突變體糠醛耐受性的關鍵突變位點的功能鑒定為闡明該菌糠醛耐受的機制、運用反向代謝工程構建耐受菌株奠定了基礎。
【圖文】：

-1 以 Z.mobilis CP4 基因組為模板得到的易錯 PCR 產(chǎn)物電泳圖 the electrophorogram of ePCR products amplified from Z.mobililis CP4 的基因組。圖 b 和 c 為易錯 PCR 產(chǎn)物。P4 的基因組，大小 2 M；泳道 2：Marker D15000 (TIANGE)， bp; b: 3-6 泳道：不同引物組合的 PCR 產(chǎn)物，引物組合為 1 15 mer (6.6 μL) 和14 mer (10 μL), 12 mer (16.6 μL), 15 mer (1r Ⅲ（ TIANGE）；8 泳道：PCR 產(chǎn)物純化并濃縮 20 倍之后下依次是 4500 bp、3000 bp、2000 bp、1200 bp、800 bp、500ome of CP4; lane 2: Marker Ⅲ(TIANGE); b: lane 3-6: PCR pro12 mer (6.6 μL) and 10 mer (10 μL), 15 mer (6.6 μL) and 14 m mer (16.6 μL); lane 7 and 9: Marker Ⅲ(TIANGE); c: lanurified PCR products. The band size of DNA marker Ⅲ is 450800 bp, 500 bp, 200 bp, respectively.

圖 3-2 轉(zhuǎn)化子在 含 3 g/L 糠醛的 RM 培養(yǎng)基里的生長評價Figure 3-2 Growth curves of transformants in RM with 3 g/L furfural.2 以 F2-1 為出發(fā)菌株的第二輪全基因組改組經(jīng)第一輪改組在含 2 g/L 糠醛的 RM 固體平板上篩選出耐受糠醛。為了進一步提高 F2-1 的糠醛耐受性，進行了第二輪的全基因組2-1 的基因組，以其基因組為模板，利用最佳隨機引物組合 15 mer (er (10 μL), 12 mer (16.6 μL)進行易錯 PCR，，易錯 PCR 產(chǎn)物濃縮 20運動發(fā)酵單胞菌 F2-1 的感受態(tài)細胞，復蘇 16 h，將菌液適當稀釋糠醛濃度為 2.3 g/L、2.5 g/L 和 2.7 g/L 的 RM 平板上，30 ℃倒置培養(yǎng)菌落直徑較大的轉(zhuǎn)化子，預培養(yǎng)后在 3 g/L 糠醛，4 mL（25 mL 螺旋M 培養(yǎng)基初步篩選，獲得了 6 個生長好于野生型的轉(zhuǎn)化子。進一步轉(zhuǎn)化子在 100 mL 含 3 g/L 糠醛的 RM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。18 h 后，轉(zhuǎn)化
【學位授予單位】：天津大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：TQ223.122;TQ920.6

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本文編號：2651854