【摘要】：熱凝膠是一種由土壤桿菌發(fā)酵得到的線(xiàn)性水不溶性β-1,3-葡聚糖,分子結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單。本研究室從事熱凝膠發(fā)酵和性質(zhì)研究30多年,首次發(fā)現(xiàn)了哈茨木霉(Trichoderma harzianum CECT 2413)內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶可以有效水解熱凝膠生產(chǎn)β-1,3-葡寡糖。β-1,3-葡寡糖是一種通過(guò)葡萄糖單體以β-1,3-糖苷鍵連接的低聚寡糖,作為一類(lèi)新的生理活性物質(zhì),功能性寡糖具有抗菌、抗病毒,提高免疫活性等多種生物學(xué)功能,在疾病診斷與防治、營(yíng)養(yǎng)與保健等方面有著很大的應(yīng)用潛力。但采用哈茨木霉發(fā)酵產(chǎn)生β-1,3葡聚糖酶還存在內(nèi)切酶活性和比例較低,分離純化步驟繁瑣,生產(chǎn)成本較高等問(wèn)題。本研究首次采用畢赤酵母表達(dá)哈茨木霉來(lái)源內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶基因,進(jìn)一步通過(guò)表達(dá)條件優(yōu)化,酶學(xué)性質(zhì)和寡糖水解性質(zhì)研究,建立了一種酶法高效水解熱凝膠制備β-1,3-葡聚寡糖的方法。能夠有效降低生產(chǎn)成本,有望替代傳統(tǒng)酸水解方法,為規(guī)�；阜ㄖ苽涔δ苄云暇酃烟堑於搜芯炕A(chǔ),研究結(jié)果包含:1.實(shí)現(xiàn)了哈茨木霉內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)。通過(guò)全基因技術(shù)合成來(lái)源于Trichoderma harzianum CECT 2413內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶序列并構(gòu)建重組酵母表達(dá)載體pPIC9K-BGN13.1,用NcoⅠ線(xiàn)性化重組質(zhì)粒pPIC9K-BGN13.1,電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵母KM71基因組中進(jìn)行外源表達(dá),通過(guò)表型篩選,遺傳霉素抗性篩選,經(jīng)PCR、SDS-PAGE鑒定表明,葡聚糖酶基因整合至酵母染色體DNA中,表達(dá)的葡聚糖酶水解熱凝膠能夠得到聚合度主要為4~6的寡糖。2.對(duì)重組酵母的搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行了研究。優(yōu)化后最適發(fā)酵培養(yǎng)基為:1%的酵母膏、2%的胰蛋白胨、0.3%的氯化鈣、2%的硫酸鎂和2%的磷酸氫二鉀,1.34%的100 mM YNB和4×10~(-5)%生物素。優(yōu)化后最佳誘導(dǎo)搖瓶條件為:誘導(dǎo)培養(yǎng)基初始pH 6.0,接種量2.5%,裝液量為500 mL裝100 mL發(fā)酵液,25℃,220 r·min~(-1),每24 h加入1.5%的甲醇/山梨醇進(jìn)行誘導(dǎo),發(fā)酵4~5天。發(fā)酵上清液中內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶的蛋白含量和酶活分別是優(yōu)化前的1.26倍和1.21倍,效果較為明顯。3.在7 L發(fā)酵罐水平下,針對(duì)畢赤酵母在甲醇誘導(dǎo)期,應(yīng)用了一種低溫(25℃)與甲醇/山梨醇共混組合誘導(dǎo)策略來(lái)優(yōu)化外源蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明,采用該組合誘導(dǎo)策略后,最大內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶的蛋白含量及酶活分別是采用30℃條件下純甲醇誘導(dǎo)策略時(shí)的1.19倍和1.16倍。因此,該組合誘導(dǎo)策略同時(shí)提高了外源蛋白的含量和酶活。4.針對(duì)發(fā)酵上清液純化后的酶液,研究其酶學(xué)性質(zhì)。研究證明,重組內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶的最適pH是5.5,最適反應(yīng)溫度為50℃,在pH 4.5~6.5,溫度45~60℃的條件下較穩(wěn)定,相對(duì)酶活力在80%以上;Mg~(2+)、Cu~(2+)和Zn~(2+)對(duì)其水解活性能夠發(fā)揮激活功效;Ca~(2+)、Fe~(2+)對(duì)內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶酶活的影響較小;Hg~(2+)、Ag~+抑制比較明顯,其次是Fe~(3+);水解熱凝膠制備的寡糖聚合度(degree of polymerization,DP)主要集中在4~6,DP 7~10的寡糖含量較少,葡萄糖、DP 2~3的寡糖幾乎沒(méi)有。
【圖文】：

圖 1-1 功能性多糖結(jié)構(gòu)圖Fig. 1-1 The Molecular structure of functional polysaccharide糖有廣泛的來(lái)源渠道，資源較為豐富，能夠直接提取自要有超聲波和微波提取法、酶法、酸堿提取法等[7]。目前含酵母葡聚糖與昆布多糖。酵母β-1,3-葡聚糖是酵母細(xì)胞

圖 1-3 直鏈β-1,3-葡寡糖Fig. 1-3 Molecular structure of liner β-1,3-glucooligosaccharides糖很難被人體消化吸收，，其提供的能量值不高，因此常用
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：TQ929.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2635336