發(fā)布時間：2020-04-21 03:43

【摘要】：脊髓損傷(SCI)可引起患者嚴重的神經功能障礙或永久性殘疾。治療脊髓損傷的研究大致可分為兩個主要領域:神經保護和神經再生。神經保護療法側重于阻止繼發(fā)性損傷的進一步發(fā)展,而神經再生療法則側重于通過修復斷裂的脊髓神經回路來恢復受損或失去的功能。大量的研究報告顯示活性氧(ROS)在脊髓損傷后過量產生,并在繼發(fā)性損傷的級聯反應中發(fā)揮關鍵性作用,清除ROS可以防止或減輕SCI后的繼發(fā)性損傷。為此,本論文首先設計合成了一系列ROS響應性的高分子材料,并研究其氧化響應性性質及用作活性氧響應性藥物載體的潛力。將其中一種活性氧響應性的材料制備成脂質聚合物納米粒子探索其脊髓損傷后清除ROS的神經保護治療效果。同時,針對脊髓損傷修復過程中存在的多重再生障礙,設計、制備了一種同時擔載神經干細胞、西妥昔單抗和FTY720藥物的多功能可注射水凝膠,系統研究了其在脊髓損傷后的神經再生作用。具體研究內容和主要結論如下:(1)設計合成了一種用苯硼酸頻哪醇酯連接的ROS響應性PEG化脂質材料mPEG2k-PBPE-DSA。首先通過Passerini反應合成了含有苯硼酸頻哪醇酯的末端帶有炔基的聚乙二醇單甲醚衍生物mPEG2k-PBPE-alkynyl,然后與疊氮化雙硬脂酸甘油酯(N3-DSA)通過Cu(Ⅰ)催化的點擊反應,制備成具有H2O2響應性的mPEG2k-PBPE-DSA。在含有 H2O2 的水溶液中,mPEG2k-PBPE-alkynyl 可以被H2O2氧化,并且氧化程度隨H2O2的濃度增加而加快�；谠�1HNMR和質譜分析,證明了 mPEG2k-PBPE-DSA的氧化斷裂機理。另外,mPEG2k-PBPE-DSA可以在水溶液中自組裝成穩(wěn)定的納米膠束。該膠束可以被MCF-7細胞內吞,對巨噬細胞RAW264.7有很好的生物相容性。DLS結果顯示H2O2條件下mPEG2k-PBPE-DSA納米粒子的粒徑逐漸減小,證明該納米膠束可以在H2O2存在時被氧化最終解體。此外,體外藥物釋放實驗表明擔載尼羅紅模型藥物的納米粒子能夠實現藥物的氧化響應性控制釋放。上述實驗表明,mPEG2k-PBPE-DSA有望用作活性氧響應性納米藥物載體。(2)將1,4二噻烷結構引入聚氨基酸側鏈,合成了一種新型ROS響應性聚氨基酸材料。首先,通過縮合反應制備1,4-二噻烷修飾的L-谷氨酸酯(DTG),并合成相應的α-氨基-N-羧基內酸酐單體(DTGNCA);再利用端氨基聚乙二醇單甲醚mPEG5k-NH2引發(fā)開環(huán)聚合,合成具有1,4-二噻烷側鏈的聚谷氨酸嵌段共聚物mPEG-b-PDTG。該兩親性聚合物在水環(huán)境中自組裝成球狀納米粒子。用DLS,紅外和濁度實驗研究納米粒子的H202響應行為。結果顯示,在H202水溶液中,1,4-二噻烷的硫醚結構被氧化成亞砜,從而使聚合物由兩親性變成親水性,導致納米粒子解體。納米粒子的氧化速率隨H202濃度的增加而加快,而無H2O2存在時,納米粒子保持穩(wěn)定。同時,體外藥物釋放實驗表明擔載尼羅紅模型藥物的納米粒子能夠實現藥物的氧化響應性控釋。上述實驗表明,含1,4二噻烷側基的聚氨基酸材料有望用作ROS響應性納米藥物載體。(3)開發(fā)了活性氧響應性脂質聚合物納米粒子作為活性氧清除劑,以減輕急性脊髓損傷后的繼發(fā)性損傷。采用簡單的硫醇-炔點擊聚合法制備了一種高密度硫醚基聚合物,即聚丙二醇(甲硫基)乙酸酯-乙二醇二(β-巰基丙酸酯)[poly(PMT-co-EGDM)],并用卵磷脂(lethicin)和 PEG-DSPE 的混合物進一步包封,形成活性氧響應性脂質聚合物納米粒子,稱為PELPNPs。體外實驗表明該PELPNPs能清除過量產生的ROS,減輕炎癥反應,保護膠質細胞和神經元免受H2O2誘導的氧化損傷。動物實驗結果表明,PELPNPs通過對神經元和髓鞘的有效保護,減少了損傷面積,明顯改善了 SCI大鼠的運動功能的恢復。此外,我們還對PELPNPs的作用機理進行了驗證研究,而且其在體內外均表現出良好的生物相容性和生物安全性。因此,我們提出的具有ROS清除功能的脂質聚合物納米粒子在SCI的抗氧化治療方面具有較大的潛力。(4)用氧化葡聚糖(o-Dex)和末端肼解的四臂聚乙二醇(4-arm-PEG-NHNH2),通過醛基和肼形成腙鍵作為交聯點,制備出可注射的共價適應性水凝膠Gel4P-hy-D。該水凝膠快速成膠,模量和脊髓組織相似,且有一定的膨脹性和粘附性,適用于受損脊髓處的填充。我們用Gel4P-hy-D水凝膠搭載神經干細胞(NSCs),同時加入促進NSCs向神經元分化的西妥昔單抗和抑制膠質瘢痕的藥物FTY720,制備成具有多功能的可注射水凝膠(G-N-C-F)。體外和體內實驗研究結果表明,西妥昔單抗和FTY720對神經再生具有協同作用。將G-N-C-F注射到急性脊髓橫斷損傷大鼠的損傷部位,驗證其對脊髓再生和功能恢復的治療作用。實驗結果證明,植入G-N-C-F的大鼠可以增加脊髓損傷中心的神經元數量,減少膠質瘢痕的產生,促進軸突再生,從而更好的重建受損神經網絡,最終有助于脊髓損傷大鼠運動功能的恢復。對比實驗說明多功能的可注射水凝膠的組織修復效果優(yōu)于單一功能的水凝膠。該多功能的可注射水凝膠為SCI的神經再生治療提供了新的思路,有望用于SCI的臨床研究。
【圖文】：

第一章緒論逡逑１．１脊髓逡逑脊髓分為灰質（包含神經元細胞體）和白質（包含有髓鞘的軸突）（圖１．１ａ）。逡逑白質可以進一步細分為幾個上升或下降的束，這些束由軸突束組成，軸突束起源逡逑于大腦和周圍的特定區(qū)域并投射到這些區(qū)域、這些束傳輸特定的信息，包括感逡逑覺信息（如溫度或瘙癢）或運動信息。脊髓神經根進入脊髓并將感覺信息傳遞到逡逑脊髓（通過感覺根或背根）或將運動信息傳遞到周圍（通過運動根或腹根）。脊逡逑柱將脊髓包裹在保護性的骨骼和韌帶中，人類將其分為７節(jié)頸椎、１２節(jié)胸椎、５逡逑節(jié)腰椎和５節(jié)骶骨。血液由位于脊髓前方、后方和分支處的動脈供應給脊髓，以逡逑灌注脊髓實質。脊髓也被包含在厚膜內的腦脊液保護層所包圍（圖１．１ｂ）。脊髓逡逑（圖１．１ｃ）的每個節(jié)段區(qū)域都支配著皮膚（圖ｌ．ｌｄ）、肌肉（圖ｌ．ｌｅ）或器官群逡逑的特定區(qū)域。脊髓損傷可導致損傷部位以下的部分或全部功能喪失。逡逑ａ邐Ｖｅｎｔｒａｌ邋ｃｏｒｔｉｃｏｓｐｉｎａｌ邋ｔｒａｃｔ邐ｃ邐１、二：’￥＇■＜■、、、邐＾邋Ｔ逡逑Ｄｏｒｓａｌ邋ｃｏｌｕｍｎ邋Ｔｅｃｔｏｓｐｉｎａｌ邋ｔｒａｃｔ邐Ｊ逡逑ｖ—感公}／人＇邋；逡逑Ｌａｔｅｒａｌ邐Ｒｅｔｉｃｕｌｏｓｐｉｎａｌ邋ｔｒａｃｔ邐Ｐ＾ＣＡ邋＞．邋Ｔ２邋＾Ｃ４逡逑ｉｐｈｗｔｂｄｌａｍｉｃ邐，邐、了卜＼逡逑ｃｏ＇ｒｔＴｃｏｓｐｉ＾ｌ邐Ｂｒａｉｎｓｔｅｍ逡逑象ｒ栜逡逑ｂ邋＼＾ｖ邋／——邋考，，亦逡逑■：二邋＿逡逑ｒ邋八邐贏邋＼邐’晶、邐ＣＳ邐Ｂｂｏｗ邋ｆｌｅｘｏｒｓ逡逑；＾＼邐Ｃ６邐Ｗｒｉｓｔ邋ｅｘｔｅｎｓｏｒｓ逡逑／NB邐：＇翁；．邐~k榦邐邋Ｃａｕｄａ邐Ｃ７邋Ｅｌｂｏｗ邋ｅｘｔｅｎｓｏｒｓ逡逑

１．３脊髓損傷的分類和病理逡逑１．３．１原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷（二次損傷）逡逑如圖１．２所示，ＳＣＩ可分為原發(fā)性損傷（ｐｒｉｍａｒｙ邋ｉｎｊｕｒｙ）和繼發(fā)性損傷逡逑（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ邋ｉｎｊｕｒｙ，又叫二次損傷）。原發(fā)性損傷是最初創(chuàng)傷時的物理力的結果，逡逑通常是損傷嚴重程度最重要的決定因素；所涉及的物理力可包括壓縮、剪切、撕逡逑裂和急性拉伸／分離等。繼發(fā)性損傷是繼原發(fā)性損傷之后的一種遲發(fā)性和進行性逡逑組織損傷，會進一步擴大神經組織損傷的范圍，并加劇神經功能缺損６。逡逑圖１．２脊髓損傷的分類７逡逑２逡逑
【學位授予單位】：中國科學技術大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R651.2;TQ427.26

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