【摘要】：隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展與科技的進(jìn)步,人們對(duì)生活品質(zhì)要求日益提高,而全球環(huán)境尤其是海洋環(huán)境問題日益凸顯。海洋紅酵母作為海洋環(huán)境中一類抗逆性極強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)菌群,菌體營養(yǎng)成分豐富,能夠代謝包括蝦青素在內(nèi)的多種類胡蘿卜素,且具有降解石油化合物及凈化水體等多種生理功能,近年來成為研究熱點(diǎn)。蝦青素因其具備極強(qiáng)的抗氧化、衰老能力,以及著色功能,在食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)有廣闊的應(yīng)用前景。蝦青素等類胡蘿卜素?zé)o法在動(dòng)物體內(nèi)自發(fā)生成,目前微生物是類胡蘿卜素獲取的良好來源。海洋紅酵母能夠代謝產(chǎn)生大量類胡蘿卜素,且具備發(fā)酵條件簡單、生長周期短等特點(diǎn),因此,本研究以極地海洋紅酵母Rhodotorula sp.為目標(biāo),探究其高效液相色譜洗脫條件,優(yōu)化其發(fā)酵培養(yǎng)方式,分離純化其代謝產(chǎn)物以及對(duì)代謝產(chǎn)物的生物活性進(jìn)行了研究。首先是高效液相色譜洗脫條件的確立。采用高效液相色譜法對(duì)海洋紅酵母Rhodotorula sp.的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析測(cè)定。對(duì)乙酸銨甲醇和甲酸乙腈兩個(gè)體系進(jìn)行擇優(yōu)選取,通過不同時(shí)間及流動(dòng)相配比的反復(fù)調(diào)試分析,最終確立了最優(yōu)的梯度分離條件:50 m M乙酸銨和甲醇體系(0-15 min:1%甲醇,99%50 m M乙酸銨;15-60 min:60%甲醇,40%50 m M乙酸銨),檢測(cè)波長265 nm,流速1 m L/min,柱溫35℃,安譜C18柱(25 mm×4.6 mm,5μm),進(jìn)樣量10μL。對(duì)發(fā)酵液的制備方式進(jìn)行了研究,通過對(duì)原始發(fā)酵液、上清液發(fā)酵液以及菌體發(fā)酵液進(jìn)行高效液相色譜分析,最終采用處理方式為:在原始發(fā)酵液中加入適量甲醇,使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其濃縮制備成待測(cè)樣品。其次是海洋紅酵母Rhodotorula sp.主要代謝產(chǎn)物的確定以及優(yōu)化其發(fā)酵培養(yǎng)條件。對(duì)蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行高效液相色譜分析,初步進(jìn)行推斷其主要代謝產(chǎn)物即第19.4 min中出峰的代謝產(chǎn)物為蝦青素。進(jìn)一步通過質(zhì)譜分析以及核磁共振分析,確定海洋紅酵母Rhodotorula sp.的主要代謝產(chǎn)物是蝦青素,產(chǎn)量為18.6mg/m L。對(duì)其產(chǎn)蝦青素的發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,通過單因素實(shí)驗(yàn)表明,海洋紅酵母Rhodotorula sp.發(fā)酵生成蝦青素的最優(yōu)乙酰水楊酸的添加量為100.00 mg/L,最優(yōu)硫酸鋅的添加量為100.00 mg/L,最優(yōu)發(fā)酵時(shí)間為5天。采用響應(yīng)面法對(duì)海洋紅酵母Rhodotorula sp.產(chǎn)蝦青素發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,建立了海洋紅酵母Rhodotorula sp.發(fā)酵培養(yǎng)條件的回歸模型,對(duì)回歸方程求解,當(dāng)蝦青素產(chǎn)量達(dá)到最大值27.00 mg/m L時(shí),發(fā)酵時(shí)間為6.64天,硫酸鋅添加量為113.50 mg/L,乙酰水楊酸添加量為111.00 mg/L。為方便實(shí)際操作,由該模型優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)條件為:發(fā)酵時(shí)間為6天,硫酸鋅添加量為113.00 mg/L,乙酰水楊酸添加量為111.00 mg/L。此條件下,蝦青素產(chǎn)量為28.40 mg/m L,與模型預(yù)測(cè)相近,進(jìn)一步驗(yàn)證了該模型的可靠性。經(jīng)過優(yōu)化后的蝦青素產(chǎn)量提高了52.7%。最優(yōu)的海洋紅酵母Rhodotorula sp.產(chǎn)蝦青素的發(fā)酵條件為:活化培養(yǎng)基:葡萄糖(20 g/L),牛肉膏蛋白胨(10 g/L),酵母提取物(5 g/L),氯化鈉(10 g/L),硫酸鎂(3 g/L),磷酸氫二鉀(7 g/L),活化1天。發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖(20 g/L),牛肉膏蛋白胨(10 g/L),酵母提取物(15 g/L),氯化鈉(10 g/L),硫酸鎂(0.15 g/L),磷酸氫二鉀(0.25 g/L),吐溫(1 g/L),硫酸鋅(113 mg/L),乙酰水楊酸(111 mg/L),發(fā)酵6天。最后是對(duì)海洋紅酵母Rhodotorula sp.的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離純化以及對(duì)代謝產(chǎn)物的生物活性進(jìn)行相關(guān)研究。使用制備型高效液相色譜,分離純化得到了5種代謝產(chǎn)物,使用高效液相色譜、質(zhì)譜以及核磁共振分析,明確了這5種化合物是蝦青素的不同構(gòu)型。對(duì)海洋紅酵母Rhodotorula sp.的主要代謝產(chǎn)物蝦青素進(jìn)行了纖溶活性評(píng)價(jià)、DPPH自由基清除能力評(píng)價(jià)、羥自由基清除能力評(píng)價(jià)、超氧陰離子清除能力評(píng)價(jià)、紅外光譜分析以及紫外波長吸光度分析。海洋紅酵母Rhodotorula sp.代謝產(chǎn)生并分離純化得到的蝦青素不具備纖溶活性能力;稀有的極地海洋紅酵母來源的蝦青素具有較高的抗氧化活性。在清除DPPH自由基方面,其清除能力在低濃度時(shí)次于維生素C,在高濃度時(shí)與維生素C相當(dāng),顯著優(yōu)于海洋紅球藻源蝦青素和維生素E;在清除羥自由基與超氧陰離子方面,其清除能力顯著優(yōu)于Vc、Ve和AXH。極地海洋紅酵母來源的蝦青素的抗氧化活性優(yōu)良,且優(yōu)于Vc、Ve和AXH;在紅外光譜中,由于蝦青素結(jié)構(gòu)中的C=O鍵、芳香族里的C=C鍵以及C-C共軛體系中的C-H鍵的伸縮振動(dòng)從而形成了3個(gè)明顯的吸收峰;通過紫外分光光度計(jì)在200-600 nm處對(duì)蝦青素的吸光度的掃描,得到蝦青素在480nm出有最大特征性吸收。
【圖文】：

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文2.2.3 海洋紅酵母（Rhodotorula sp.）的 HPLC 條件的優(yōu)化采用高效液相色譜法分析檢測(cè)海洋紅酵母Rhodotorula sp.的發(fā)酵次生代謝產(chǎn)物。取 1 mL 制備好的三種樣品分別使用 0.22 μm 的有機(jī)相濾膜至高效液相棕色瓶里，并使用分析型高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。高效液相色譜的洗脫條件建立了兩個(gè)體系，，分別為甲酸乙腈體系和乙酸銨甲醇體系。對(duì)這兩個(gè)體系分別進(jìn)行梯度濃度的調(diào)整，以確定最優(yōu)液相色譜洗脫條件，洗脫梯度如圖 2-1 所示。檢測(cè)波長265 nm，柱溫 35 ℃，安譜 C18 柱（25 mm ×4.6 mm, 5 μm），進(jìn)樣量為 10 μL 。

表 2-1 甲酸乙腈體系洗脫方法Table 2-1 Method for eluting formic acid acetonitrile system時(shí)間（min） % 0.1%甲酸 %乙腈 流量（mL/min）0.0 99 1 115.0 99 1 160.0 55 45 1
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：O657.72;TQ920.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 張泳;厲妙沙;吳嘉圣;;分光光度法測(cè)定蝦青素[J];浙江化工;2015年09期

2 孫建男;謝為天;劉穎;徐春厚;;海洋紅酵母的研究進(jìn)展[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2015年04期

3 劉雨;陳霞;宋琦;胡發(fā)明;馬興群;;海洋紅酵母的作用機(jī)理及其在畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J];飼料博覽;2014年04期

4 孫偉紅;林洪;翟毓秀;冷凱良;邢麗紅;;紅發(fā)夫酵母中3R,3’R-蝦青素的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定[J];食品科學(xué);2014年11期

5 蘇同偉;包斌;嚴(yán)婷;張朝燕;卜永士;吳文惠;;響應(yīng)面法優(yōu)化海洋微生物發(fā)酵產(chǎn)生纖溶化合物的培養(yǎng)條件[J];生物工程學(xué)報(bào);2013年06期

6 陶姝穎;明建;;蝦青素的功能特性及其在功能食品中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J];食品工業(yè);2012年08期

7 王幸;吳文惠;孫立春;陳志華;張潔;包斌;;具有纖溶活性作用的海洋真菌代謝產(chǎn)物的分離與菌株鑒定[J];天然產(chǎn)物研究與開發(fā);2012年01期

8 王海兵;吳曉英;劉世龍;徐瑩瑩;;紅酵母番茄紅素提取工藝優(yōu)化[J];食品科學(xué);2011年16期

9 王宇光;雷祿旺;劉秀蓮;李偉;;海南海域海洋紅酵母的分離鑒定和應(yīng)用性能評(píng)價(jià)[J];中國農(nóng)學(xué)通報(bào);2009年22期

10 陸亞鵬;趙育;;蝦青素-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的制備與穩(wěn)定性[J];江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2008年06期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 胡婷婷;對(duì)蝦加工副產(chǎn)物中蝦青素的提取制備及其生物活性研究[D];福建農(nóng)林大學(xué);2014年

本文編號(hào)：2633907