【摘要】：我國(guó)豐富的玉米秸稈資源沒有被充分利用而廢棄造成了有效資源的浪費(fèi)和嚴(yán)重的環(huán)境污染。為了提高秸稈資源綜合利用效率,國(guó)家制定了《“十三五”秸稈綜合利用實(shí)施方案》,《方案》指出應(yīng)不斷完善秸稈收儲(chǔ)運(yùn)體系,持續(xù)推進(jìn)秸稈肥料化、飼料化、燃料化、基料化和原料化綜合利用。微生物在秸稈飼料化、肥料化等農(nóng)業(yè)為主的秸稈綜合利用中是核心,所以篩選、構(gòu)建、分析具有特定功能的微生物在秸稈資源綜合利用中具有重要意義。目前,我國(guó)已經(jīng)成功篩選出大量高產(chǎn)纖維素酶的菌株,但大部分集中在真菌方面研究,大多數(shù)真菌可高產(chǎn)纖維素酶,但由于培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng),溫度和p H耐受性差等原因使其在工業(yè)上生產(chǎn)具有一定局限性。益生菌與真菌相比具有更強(qiáng)的優(yōu)勢(shì),尤其是芽孢桿菌,芽孢桿菌因易篩選,抗逆性強(qiáng)(耐酸,耐堿,耐高溫),而易于工業(yè)化生產(chǎn)。有些芽孢桿菌可產(chǎn)生豐富的木質(zhì)纖維素酶,所以在生物質(zhì)轉(zhuǎn)化方面中發(fā)揮重要作用。因此,本研究利用多種木質(zhì)纖維素酶篩選培養(yǎng)基,從杜仲樹皮內(nèi)篩選到一株植物內(nèi)生菌,命名為Bacillus velezensis 157,該菌株具有產(chǎn)生豐富木質(zhì)纖維素酶優(yōu)勢(shì),同時(shí)具有抑制病原細(xì)菌和真菌的能力。進(jìn)而對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行分析、CMCase產(chǎn)酶條件優(yōu)化以及酶學(xué)性質(zhì)分析研究。系統(tǒng)地開展了對(duì)Bacillus velezensis157全基因組測(cè)序、生物信息學(xué)分析、木質(zhì)纖維素降解酶基因的挖掘,比較基因組學(xué)揭示了Bacillus velezensis同種間攜帶木質(zhì)纖維素降解酶基因情況。最后將Bacillus velezensis 157分別在固態(tài)發(fā)酵預(yù)處理秸稈、發(fā)酵豆粕以及混合固態(tài)發(fā)酵預(yù)處理秸稈-豆粕混合物(AWC)等應(yīng)用基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)中,利用掃描電鏡、傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜、GC-MS產(chǎn)物分析、木質(zhì)纖維素含量測(cè)定等試驗(yàn)評(píng)價(jià)Bacillus velezensis 157固態(tài)發(fā)酵預(yù)處理秸稈,豆粕以及預(yù)處理秸稈-豆粕混合物的降解效果,詳細(xì)分析了各組產(chǎn)纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶、淀粉酶,進(jìn)一步通過單因素法優(yōu)化混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶條件等。預(yù)期結(jié)果將對(duì)生物質(zhì)能源的轉(zhuǎn)化與利用提供新的創(chuàng)新思路。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:1.高產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌的分離鑒定及部分生物學(xué)特性分析本研究成功在杜仲樹皮內(nèi)分離一株芽孢桿菌,經(jīng)菌落形態(tài)、傳統(tǒng)生理生化鑒定、全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)和16S r RNA分子生物學(xué)技術(shù)初步鑒定芽孢桿菌157為Bacillus velezensis。該菌株能夠在p H2-12條件下生長(zhǎng)、其最適p H為6,可以耐受0.4%膽鹽和85℃高溫。該菌株具有豐富的內(nèi)切纖維素酶、木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶、果膠酶、木質(zhì)素酶等胞外酶活力。在未經(jīng)液態(tài)發(fā)酵優(yōu)化前,其CMCase和FPAse分別可達(dá)4.78 IU/m L和0.73 IU/m L。Bacillus velezensis 157對(duì)19種獸醫(yī)臨床常用的抗生素敏感,動(dòng)物試驗(yàn)安全無毒。Bacillus velezensis 157胞外提取物具有廣譜抑菌作用,對(duì)7種動(dòng)物病原細(xì)菌(Staphylococcus aureus CVCC519、Escherichia.coli CVCC233、Escherichia.coli CVCC236、Escherichia.coli CVCC196、Escherichia.coli CVCC205、Escherichia.coli BNCC125988、Salmonella Typhimurium ATCC25241、Salmonella choleraesuis CVCC3383、Salmonella choleraesuis CVCC3775、Salmonella choleraesuis CVCC79102、Salmonella choleraesuis CVCC503、Salmonella choleraesuis CVCC3780、Salmonella enteritidis CVCC3378、Clostridium perfringens、Proteus hauseri)、4種水產(chǎn)病原細(xì)菌(Aeromonas hydrophila ATCC7966、Aeromonas veronii ATCC35624、Aeromonas veronii TH0426、Aeromonas veronii AV115、Aeromonas veronii AV75、Aeromonas caviae ATCC15468、Streptococcus agalactiae)、2種植物病原真菌(Botrytis cinerea和Fusarium oxysporum)均有一定抑制作用。2.Bacillus velezensis 157 CMCase產(chǎn)酶條件優(yōu)化及其酶學(xué)性質(zhì)分析以CMC為碳源(3g/L)、酵母浸粉為氮源(3g/L)、3%接菌量、p H=7的條件下37℃培養(yǎng)48小時(shí),產(chǎn)酶條件優(yōu)化后Bacillus velezensis 157的CMCase最高可達(dá)5.08±0.14 IU/m L。經(jīng)CMCase酶學(xué)性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)Bacillus velezensis 157的最適酶反應(yīng)溫度為60℃、最適p H為5、具有較好的p H穩(wěn)定性和Na Cl耐受性,屬于內(nèi)切型纖維素酶。Km=5.59 mg/m L、Vmax=5.81μg/m L·min、Na+、Mg2+、Ca2+可以誘導(dǎo)Bacillus velezensis157 CMCase,而Co2+、Hg2+、Fe2+、Cu2+和SDS抑制CMCase酶活力;表面活性劑Tween 80、Tween 20、Triton X-100對(duì)Bacillus velezensis 157的CMCase無影響。為了實(shí)驗(yàn)分析構(gòu)建了重組Bacillus velezensis157 CMCase的原核表達(dá)菌株p ET32a-157-CMCase BL21(DE3),并進(jìn)行了重組CMCase的酶學(xué)性質(zhì)分析,其最適酶反應(yīng)溫度和p H值分別為50℃和p H6,具有較好的p H耐受性,與野生菌株Bacillus velezensis 157 CMCase的酶學(xué)性質(zhì)相似,但重組Bacillus velezensis 157 CMCase具有更好的溫度穩(wěn)定性和底物親和力,為實(shí)驗(yàn)研究提供了方便。3.Bacillus velezensis 157全基因組測(cè)序及比較基因組分析對(duì)Bacillus velezensis 157進(jìn)行了全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)其具有一個(gè)環(huán)形染色體和環(huán)形質(zhì)粒分別為4,013,317bp和8439bp,同時(shí),全基因組含有8個(gè)次級(jí)代謝基因簇,占全基因組比例的15.8%,主要包括:Surfactin、Butirosin、Macrolactin、Bacillaene、Fengycin、Difficidin、Bacillibactin、Bacilysin。除此之外,Bacillus velezensis 157基因組中還具有降解纖維素、木聚糖、淀粉、甘露聚糖、半乳糖和阿拉伯聚糖的木質(zhì)纖維素酶基因。經(jīng)24株Bacillus velezensis比較基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)Bacillus velezensis菌株之間具有眾多共同的木質(zhì)纖維素降解酶基因,且主要針對(duì)纖維素和半纖維素的降解;其中,參與纖維素降解的共有GH家族主要包括:GH1、GH4、GH5、GH13、GH16、GH30、GH32;涉及半纖維素降解的共有GH和CE家族包括:GH11、GH26、GH43、GH51、GH53、CE3和CE7。而缺乏降解木質(zhì)素的相關(guān)酶基因,僅涉及AA4、AA6、AA7、AA10。4.Bacillus velezensis 157在混合固態(tài)發(fā)酵預(yù)處理玉米秸稈-豆粕產(chǎn)酶功能的研究通過對(duì)Bacillus velezensis157在固態(tài)發(fā)酵最適底物的篩選發(fā)現(xiàn),豆粕是Bacillus velezensis 157固態(tài)發(fā)酵的最適底物。與其他底物相比,其CMCase、Amylase和Pectinase的最高酶活力分別可達(dá)46.69±1.19 U/g、2097.18±15.28 U/g和19.15±2.66 U/g。為了提高Bacillus velezensis157固態(tài)發(fā)酵玉米秸稈的利用率和產(chǎn)酶量,將玉米秸稈進(jìn)行稀堿預(yù)處理后與豆粕進(jìn)行混合發(fā)酵,并對(duì)其固態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)堿處理秸稈與豆粕的比例為1:1,底物與水的比例為1:0.5,在37℃下發(fā)酵24h,其產(chǎn)生的CMCase、Amylase、Xylanase以及Pectinase均高于單一發(fā)酵豆粕組和堿處理玉米秸稈組,其酶活力分別可達(dá)56.83±1.47 U/g(P0.01)、1949.28±14.41U/g(P0.01)、16.52±0.79 U/g、14.53±0.56 U/g(P0.01)。通過掃描電鏡、傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜、木質(zhì)纖維素含量測(cè)定以及GC-MS分析等技術(shù),對(duì)Bacillus velezensis 157固態(tài)發(fā)酵堿處理秸稈組AWC組以及豆粕組的降解效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。經(jīng)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn),Bacillus velezensis 157固態(tài)發(fā)酵AWC組出現(xiàn)大面積木質(zhì)纖維素降解孔洞,菌株數(shù)量大幅增加\密集排布。經(jīng)FTIR、木質(zhì)纖維素含量測(cè)定以及GC-MS分析發(fā)現(xiàn)AWC組中部分纖維素和半纖維素出現(xiàn)大量降解,經(jīng)過10天發(fā)酵,纖維素和半纖維素降解率分別為9.06%和43.61%,AWC組GC-MS降解產(chǎn)物中葡萄糖、甘露醇、半乳糖、木糖、纖維二糖、麥芽三糖醇以及葡萄糖醛酸等物質(zhì)的峰面積增強(qiáng),主要是纖維素?zé)o定型區(qū)、半纖維素以及淀粉發(fā)生了降解。綜上所述,本文篩選的杜仲樹皮內(nèi)生菌Bacillus velezensis 157,通過試驗(yàn)驗(yàn)證具有降解纖維素和半纖維素能力;此外,通過對(duì)Bacillus velezensis 157的部分生物學(xué)特性研究和酶學(xué)性質(zhì)分析以及全基因組測(cè)序分析等獲得的數(shù)據(jù)為下一步應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。也為Bacillus velezensis 157進(jìn)一步應(yīng)用于固態(tài)發(fā)酵處理農(nóng)業(yè)廢棄物提供了參考,具有重要意義。
【圖文】：

堆肥 DF-1 3.05 1.56 0.13DF-6 3.15 1.59 0.16DF-16 4.27 1.86 0.15DF-18 4.3 2.45 0.42土壤 TR-5 4.92 2.85 0.21TR-8 3.92 1.99 0.38TR-13 4.2 1.42 0.08TR-17 3.33 0.83 0.03TR-18 4.08 1.62 0.12TR-21 3.47 1.27 0.08TR-25 3.92 1.10 0.041.3.2 芽孢桿菌其他酶活的篩選經(jīng) DNS 法檢測(cè)內(nèi)切纖維素酶、濾紙酶活力較高的菌株 LV-29、DZ-155、DZ-157、YX76、YX113 進(jìn)行其他酶活的篩選。包括蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、木聚糖酶、木質(zhì)素酶，經(jīng)篩選后發(fā)現(xiàn)僅菌株 157 具有以上所有酶活，因此作為目標(biāo)菌株供后續(xù)研究，結(jié)果見圖 1.1。

產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌的鑒定形態(tài)學(xué)鑒定株 157 進(jìn)行菌落形態(tài)特征、革蘭氏染色法、芽孢染色法初步鑒定，，以生物生理生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。本菌株為短桿菌，乳白色，菌落有口”凸起，菌落表面有褶皺，邊緣整齊（圖 1.2），革蘭氏染色陽性，能，具有運(yùn)動(dòng)性，在有氧情況下大量生長(zhǎng)，厭氧狀態(tài)下生長(zhǎng)狀態(tài)不佳，1-5 和 1-6。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：TQ925


本文編號(hào)：2620782