【摘要】：螺旋藻藻藍蛋白可以從天然的藍藻中提取,也可以通過其它生物異源重組產生。研究表明,重組產生的藻藍蛋白和天然藻藍蛋白相比,具有相似的光譜特征,但表現(xiàn)出更強的抗氧化活性。基于從藍藻中提取藻藍蛋白復雜的分離純化工藝,從大腸桿菌中合成生產藻藍蛋白是更好的選擇。本研究從鹽澤螺旋藻Spirulina subsalsa FACHB351中PCR擴增藻藍蛋白β亞基生物合成相關的編碼基因(藻藍蛋白β亞基編碼基因cpcB、裂合酶編碼基因cpcT和cpcS、藻藍膽素合成酶編碼基因ho?和pcyA),克隆到表達載體,構建表達質粒pETDuet-cpcB-cpcS::ho1::pcyA。轉化表達質粒到大腸桿菌細胞,合成熒光藻藍蛋白PCB-CpcB(C-82),最大吸收波長為620 nm,最大熒光發(fā)射波長為640 nm。當用cpcT代替cpcS時,則合成熒光藻藍蛋白PCB-CpcB(C-153),最大吸收波長為590 nm,最大熒光發(fā)射波長為620 nm。本研究中采取單個質粒的表達策略避免多質粒轉化的缺陷,減輕因抗生素的使用對環(huán)境造成的污染,降低生產成本,增加外源蛋白表達的穩(wěn)定性。大腸桿菌具有周質空間,重組蛋白轉移到細胞周質空間或者分泌到培養(yǎng)基中比胞內生產具有多項優(yōu)勢。本研究在藻藍蛋白β亞基脫輔基蛋白編碼基因cpcB的N端融合pelB信號肽,與ho1、pebS和cpcS在大腸桿菌中共表達。結果表明可以合成重組藻藍蛋白PelB::CpcB(C-82)-PEB,并分泌到培養(yǎng)基中。胞外收集的色素蛋白光譜特征和在胞內表達的基本一致,這表明其理化性質沒有發(fā)生變化。藻藍蛋白不需要細胞破碎而直接分泌到培養(yǎng)基中,節(jié)省生產成本。為了測試重組藻藍蛋白脫輔基蛋白的抗氧化活性,本研究在大腸桿菌中表達Spirulina subsalsa、Mastigocladus laminosus和Nostoc PCC 7120藻藍蛋白β亞基脫輔基蛋白CpcB_(Sp)、CpcB_(Ma)和CpcB_(No)。通過測定它們對羥基自由基和DPPH自由基的清除率比較他們的抗氧化活性。結果顯示:3種重組藻藍蛋白β亞基脫輔基蛋白都具有較高的抗氧化活性,對自由基的清除率都隨著蛋白濃度的增加而上升。在被測定的濃度中,對羥基自由基和DPPH自由基的清除率都表現(xiàn)為CpcB_(Sp)㩳CpcB_(Ma)㩳CpcB_(No)。這表明脫輔基蛋白也具有很強的抗氧化能力,而不同藻種的藻藍蛋白其抗氧化性表現(xiàn)出一定的差異。本研究進一步測試熒光重組藻藍蛋白CpcB(C-82)-PCB和CpcB(C-153)-PCB對羥基自由基和DPPH自由基的清除率并評估他們的抗氧化能力。結果顯示,CpcB(C-82)-PCB和CpcB(C-153)-PCB對羥基自由基的半清除濃度分別為38.72±2.48 ug/mL和51.06±6.74ug/m;對DPPH自由基的半清除濃度分別是201.00±5.86 ug/mL和240.34±4.03 ug/mL。重組蛋白的抗氧化能力表現(xiàn)為apo-CpcB㩳CpcB(C-153)-PCB㩳CpcB(C-82)-PCB,這與它們的色素結合率有關。熒光重組藻藍蛋白具有比脫輔基蛋白更強的抗氧化效應,可開發(fā)為抗氧化試劑,在食品和醫(yī)療藥物領域具有廣泛的應用前景。
【圖文】：

異構酶的作用下色素分子發(fā)生順反異構的結果[15]。基和β亞基組成，每條亞基由PCB和相應的脫輔基蛋 β 亞基先形成(αβ)單體，再由 3 個(αβ)單體聚合形成疊形成六聚體(αβ)6，這些多聚體結合在一起組裝形成白的 X 射線晶體衍射實驗分析表明，PC 的晶體結構會影響PC在溶液中的存在形式。如，PC在接近其等PC 溶解于 pH=6.8 溶液中時，主要以三聚體存在。

1.5 藻藍蛋白的重組生產1.5.1 藻藍蛋白的生物合成機理藻藍蛋白的合成主要包括前后兩步：首先是藻藍色素的合成，其次是脫輔基蛋白在裂合酶的催化作用下與藻藍色素的共價結合[61]。藻藍色素是開環(huán)鏈狀四吡咯色素分子，，通過硫醚鍵共價結合藻藍蛋白脫輔基蛋白半胱氨酸殘基，是藍藻重要的光感受系統(tǒng)[61]。從起源的角度，藻藍色素（PCB）來源于血紅素（Heme）的代謝，并由膽綠素(Biliverdin IXa，BV)轉化合成。PCB 的生物合成和葉綠素一樣都是由氨酸乙酰丙酸開始。如果色素合成反應系統(tǒng)中存在 Mg2+螯合酶，則反應朝著葉綠素合成方向進行；如果色素合成反應系統(tǒng)中存在Fe2+螯合酶，則反應朝著合成血紅素方向進行[62,63]。血紅素氧化酶（HO1）氧化血紅素，使其 C-5 共軛環(huán)開環(huán)斷裂，生成膽綠素 BV。BV 在膽綠素還原酶（PcyA）的作用下還原成藻藍色素[64]。血紅素在動物、植物和微生物細胞中廣泛存在。利用大腸桿菌本身含有的亞鐵血紅素，通過分子生物學和基因工程技術，向細胞中導入血紅素氧化酶和膽綠素還原酶，亞鐵血紅素即可在血紅素氧化酶的催化下轉變成膽綠素，再在膽綠素還原酶的作用下最終合成藻藍色素[65-67]。
【學位授予單位】：南京林業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：TQ93

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