【摘要】：螺旋藻藻藍(lán)蛋白可以從天然的藍(lán)藻中提取,也可以通過(guò)其它生物異源重組產(chǎn)生。研究表明,重組產(chǎn)生的藻藍(lán)蛋白和天然藻藍(lán)蛋白相比,具有相似的光譜特征,但表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化活性。基于從藍(lán)藻中提取藻藍(lán)蛋白復(fù)雜的分離純化工藝,從大腸桿菌中合成生產(chǎn)藻藍(lán)蛋白是更好的選擇。本研究從鹽澤螺旋藻Spirulina subsalsa FACHB351中PCR擴(kuò)增藻藍(lán)蛋白β亞基生物合成相關(guān)的編碼基因(藻藍(lán)蛋白β亞基編碼基因cpcB、裂合酶編碼基因cpcT和cpcS、藻藍(lán)膽素合成酶編碼基因ho?和pcyA),克隆到表達(dá)載體,構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pETDuet-cpcB-cpcS::ho1::pcyA。轉(zhuǎn)化表達(dá)質(zhì)粒到大腸桿菌細(xì)胞,合成熒光藻藍(lán)蛋白PCB-CpcB(C-82),最大吸收波長(zhǎng)為620 nm,最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)為640 nm。當(dāng)用cpcT代替cpcS時(shí),則合成熒光藻藍(lán)蛋白PCB-CpcB(C-153),最大吸收波長(zhǎng)為590 nm,最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)為620 nm。本研究中采取單個(gè)質(zhì)粒的表達(dá)策略避免多質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的缺陷,減輕因抗生素的使用對(duì)環(huán)境造成的污染,降低生產(chǎn)成本,增加外源蛋白表達(dá)的穩(wěn)定性。大腸桿菌具有周質(zhì)空間,重組蛋白轉(zhuǎn)移到細(xì)胞周質(zhì)空間或者分泌到培養(yǎng)基中比胞內(nèi)生產(chǎn)具有多項(xiàng)優(yōu)勢(shì)。本研究在藻藍(lán)蛋白β亞基脫輔基蛋白編碼基因cpcB的N端融合pelB信號(hào)肽,與ho1、pebS和cpcS在大腸桿菌中共表達(dá)。結(jié)果表明可以合成重組藻藍(lán)蛋白PelB::CpcB(C-82)-PEB,并分泌到培養(yǎng)基中。胞外收集的色素蛋白光譜特征和在胞內(nèi)表達(dá)的基本一致,這表明其理化性質(zhì)沒(méi)有發(fā)生變化。藻藍(lán)蛋白不需要細(xì)胞破碎而直接分泌到培養(yǎng)基中,節(jié)省生產(chǎn)成本。為了測(cè)試重組藻藍(lán)蛋白脫輔基蛋白的抗氧化活性,本研究在大腸桿菌中表達(dá)Spirulina subsalsa、Mastigocladus laminosus和Nostoc PCC 7120藻藍(lán)蛋白β亞基脫輔基蛋白CpcB_(Sp)、CpcB_(Ma)和CpcB_(No)。通過(guò)測(cè)定它們對(duì)羥基自由基和DPPH自由基的清除率比較他們的抗氧化活性。結(jié)果顯示:3種重組藻藍(lán)蛋白β亞基脫輔基蛋白都具有較高的抗氧化活性,對(duì)自由基的清除率都隨著蛋白濃度的增加而上升。在被測(cè)定的濃度中,對(duì)羥基自由基和DPPH自由基的清除率都表現(xiàn)為CpcB_(Sp)㩳CpcB_(Ma)㩳CpcB_(No)。這表明脫輔基蛋白也具有很強(qiáng)的抗氧化能力,而不同藻種的藻藍(lán)蛋白其抗氧化性表現(xiàn)出一定的差異。本研究進(jìn)一步測(cè)試熒光重組藻藍(lán)蛋白CpcB(C-82)-PCB和CpcB(C-153)-PCB對(duì)羥基自由基和DPPH自由基的清除率并評(píng)估他們的抗氧化能力。結(jié)果顯示,CpcB(C-82)-PCB和CpcB(C-153)-PCB對(duì)羥基自由基的半清除濃度分別為38.72±2.48 ug/mL和51.06±6.74ug/m;對(duì)DPPH自由基的半清除濃度分別是201.00±5.86 ug/mL和240.34±4.03 ug/mL。重組蛋白的抗氧化能力表現(xiàn)為apo-CpcB㩳CpcB(C-153)-PCB㩳CpcB(C-82)-PCB,這與它們的色素結(jié)合率有關(guān)。熒光重組藻藍(lán)蛋白具有比脫輔基蛋白更強(qiáng)的抗氧化效應(yīng),可開(kāi)發(fā)為抗氧化試劑,在食品和醫(yī)療藥物領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
【圖文】：

異構(gòu)酶的作用下色素分子發(fā)生順?lè)串悩?gòu)的結(jié)果[15]。基和β亞基組成，每條亞基由PCB和相應(yīng)的脫輔基蛋 β 亞基先形成(αβ)單體，再由 3 個(gè)(αβ)單體聚合形成疊形成六聚體(αβ)6，這些多聚體結(jié)合在一起組裝形成白的 X 射線晶體衍射實(shí)驗(yàn)分析表明，PC 的晶體結(jié)構(gòu)會(huì)影響PC在溶液中的存在形式。如，PC在接近其等PC 溶解于 pH=6.8 溶液中時(shí)，主要以三聚體存在。

1.5 藻藍(lán)蛋白的重組生產(chǎn)1.5.1 藻藍(lán)蛋白的生物合成機(jī)理藻藍(lán)蛋白的合成主要包括前后兩步：首先是藻藍(lán)色素的合成，其次是脫輔基蛋白在裂合酶的催化作用下與藻藍(lán)色素的共價(jià)結(jié)合[61]。藻藍(lán)色素是開(kāi)環(huán)鏈狀四吡咯色素分子，，通過(guò)硫醚鍵共價(jià)結(jié)合藻藍(lán)蛋白脫輔基蛋白半胱氨酸殘基，是藍(lán)藻重要的光感受系統(tǒng)[61]。從起源的角度，藻藍(lán)色素（PCB）來(lái)源于血紅素（Heme）的代謝，并由膽綠素(Biliverdin IXa，BV)轉(zhuǎn)化合成。PCB 的生物合成和葉綠素一樣都是由氨酸乙酰丙酸開(kāi)始。如果色素合成反應(yīng)系統(tǒng)中存在 Mg2+螯合酶，則反應(yīng)朝著葉綠素合成方向進(jìn)行；如果色素合成反應(yīng)系統(tǒng)中存在Fe2+螯合酶，則反應(yīng)朝著合成血紅素方向進(jìn)行[62,63]。血紅素氧化酶（HO1）氧化血紅素，使其 C-5 共軛環(huán)開(kāi)環(huán)斷裂，生成膽綠素 BV。BV 在膽綠素還原酶（PcyA）的作用下還原成藻藍(lán)色素[64]。血紅素在動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞中廣泛存在。利用大腸桿菌本身含有的亞鐵血紅素，通過(guò)分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)，向細(xì)胞中導(dǎo)入血紅素氧化酶和膽綠素還原酶，亞鐵血紅素即可在血紅素氧化酶的催化下轉(zhuǎn)變成膽綠素，再在膽綠素還原酶的作用下最終合成藻藍(lán)色素[65-67]。
【學(xué)位授予單位】：南京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：TQ93

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