【摘要】：黃酮類化合物以游離態(tài)或成苷的形式分布于自然界中,由于苷元及糖苷的數(shù)量、種類、連接方式的不同,使得黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)復雜多樣。黃酮類化合物具有清除自由基、抗氧化、抗腫瘤、降血脂、抗病毒等藥理活性,但是黃酮類化合物普遍水溶性差,導致其利用效率低。為了提高黃酮類化合物的水溶性,目前主要對黃酮類化合物進行結(jié)構(gòu)修飾,而去糖基化是其中一種常用手段。去糖基化包括傳統(tǒng)的化學水解和生物酶催化法,傳統(tǒng)化學方法采用硫酸或鹽酸水解黃酮類化合物,該方法反應激烈,對設備要求高,副產(chǎn)物多;生物酶催化法采用酶對黃酮類化合物進行酶水解,進而達到去糖基的作用。由于大部分黃酮類化合物末端帶有鼠李糖,進行影響其水溶性和藥理活性,而α-L-鼠李糖苷酶可以高效、專一水解黃酮類化合物的末端鼠李糖,進而增大其水溶性,提高其利用效率。因此,篩選產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶的菌株具有非常重要的意義。本研究首先從霉變的柚子及附近的土壤中采樣,初篩得到20株產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶的菌株,測定各株菌株所產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶的酶活,其中No.5號菌株所產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶酶活最高,高達484.25 U/m L。觀察No.5號菌株的菌落形態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)初步確定該菌株是黑曲霉,再將該菌株的18S rRNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫的進行同源比對,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹,該菌株的18S rRNA序列與Aspergillus Niger 513.88具有99%的相似度。因此,可以確定該菌株為黑曲霉,并命名為黑曲霉NCU-317。以酶活為優(yōu)化指標,探究黑曲霉NCU-317發(fā)酵產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶的條件,確定了培養(yǎng)基的最佳成分:4 g/L蔗糖,4 g/L酵母膏,0.2 g/L硫酸鎂,2 g/L蘆丁;最佳發(fā)酵條件:最佳發(fā)酵溫度為28℃,最佳發(fā)酵初始pH值為5,最佳轉(zhuǎn)速為180 r/min,250 mL搖瓶中最佳裝液量為100 m L,最佳發(fā)酵周期為72 h。優(yōu)化后,黑曲霉NCU-317所產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶的酶活為675.8 U/m L,是初始PDA培養(yǎng)基的1.4倍。采用(NH_4)_2SO_4分級沉淀和凝膠色譜層析對黑曲霉NCU-317發(fā)酵所產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶進行了分離純化,純化倍數(shù)分別為1.27和3.51,回收率分別為80.00%和57.86%。采用SDS-PAGE凝膠電泳和蛋白分子量與遷移率的方程,測得α-L-鼠李糖苷酶的分子量為58.1 kDa。探究了α-L-鼠李糖苷酶酶學性質(zhì),其中最適反應溫度為50℃,最適反應pH值為5,該酶具有耐高溫和耐酸性的性質(zhì),在70℃靜置2 h后,其酶活為262 U/m L,約為最適溫度下酶活的1/3,于pH值為2~7下靜置2 h后測定酶活,其酶活幾乎不受影響。Mg~(2+)和Mn~(2+)對α-L-鼠李糖苷酶具有激活作用,Fe~(2+)、Cu~(2+)和Hg~(2+)對α-L-鼠李糖苷酶起抑制作用。研究了α-L-鼠李糖苷酶的動力學,測得米氏常數(shù)K_m=14.03 mmol/(L·min),最大反應速率V_(max)=22.47 mmol/(L·min)。利用黑曲霉NCU-317所產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶催化水解蘆丁,制備異槲皮素,蘆丁的轉(zhuǎn)化率高達95%以上,采用硅膠柱層析對異槲皮素進行分離純化,用HPLC測定所得異槲皮素的純度高達99.1%,通過核磁氫譜和質(zhì)譜對異槲皮素的結(jié)構(gòu)進行了表征鑒定。
【圖文】：

黃酮類化合物母核結(jié)構(gòu)

蘆丁的結(jié)構(gòu)
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：TQ925

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 丁s，

本文編號：2614882