海藻糖因其獨特的生物學特性,具有保護生物大分子生命體特征的功能,被廣泛用于食品、藥品和化妝品中。目前,被廣泛認可的海藻糖制備工藝是單酶法。單酶法是在海藻糖合酶(TreS)的作用下,直接將麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖。轉(zhuǎn)化過程相對簡單,方便操作,但該方法依然存在不足,一是TreS主要由重組大腸桿菌誘導表達獲得;二是胞內(nèi)表達,獲得TreS需高壓均質(zhì)破碎,能耗高,設(shè)備投資大,且產(chǎn)品中易殘留內(nèi)毒素。針對上述兩點,本論文開展了以下研究工作:(1)選取密度誘導型啟動子P_srfA、組成型啟動子P₄₃和四個時期特異性啟動子P_abrB、P_spoVG、P_LytR、P_mmgA為表達元件,四個時期特異性啟動子分別在細胞生長對數(shù)期、穩(wěn)定期前期、穩(wěn)定期和衰亡期表達,將其串聯(lián)構(gòu)建得到新的啟動子P_{abrB-spoVG-LytR-mmgA},以pHT01質(zhì)粒為表達載體,構(gòu)建了自誘導表達海藻糖合酶的重組枯草芽孢桿菌,并將重組菌分別在搖瓶和發(fā)酵罐中發(fā)酵驗證,得到表達酶活高的重組菌B....

【文章頁數(shù)】：84 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第1章 緒論
    1.1 海藻糖概述
        1.1.1 海藻糖的特征
        1.1.2 海藻糖的功能與應(yīng)用
        1.1.3 海藻糖主要的制備方式
    1.2 海藻糖合酶概述
        1.2.1 海藻糖合酶的特征
        1.2.2 海藻糖合酶的作用機理
        1.2.3 海藻糖合酶的研究進展
    1.3 枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)
    1.4 枯草芽孢桿菌調(diào)控表達啟動子
    1.5 枯草芽孢桿菌蛋白分泌
    1.6 課題的立題背景和研究內(nèi)容
        1.6.1 立題背景
        1.6.2 研究內(nèi)容
第2章 海藻糖合酶在枯草芽孢桿菌中的胞內(nèi)表達
    2.1 引言
    2.2 實驗材料
        2.2.1 主要試劑
        2.2.2 儀器與設(shè)備
        2.2.3 主要培養(yǎng)基和溶液
        2.2.4 主要菌株、質(zhì)粒和引物
    2.3 實驗方法
        2.3.1 目的基因片段的獲取
        2.3.2 重組表達載體的構(gòu)建
            2.3.2.1 pHT01-P_srfA-treS表達載體的構(gòu)建
            2.3.2.2 pHT01-P₄₃-treS表達載體的構(gòu)建
            2.3.2.3 pHT01-P_{abrBspoVG-LytR-mmgA}-treS表達載體的構(gòu)建
            2.3.2.4 基因片段的擴增
            2.3.2.5 重疊片段P_srfA-treS與表達質(zhì)粒pHT01雙酶切
            2.3.2.6 片段P_srfA-treS與質(zhì)粒pHT01的連接
        2.3.3 枯草芽孢桿菌B.subtilis WB800n感受態(tài)的制備
        2.3.4 重組B.subtilis WB800n的構(gòu)建
        2.3.5 重組枯草芽孢桿菌的表達驗證
        2.3.6 海藻糖合酶的酶活力分析
    2.4 結(jié)果與討論
        2.4.1 基因的克隆
            2.4.1.1 P_srfA和treS基因片段的克隆
            2.4.1.2 P₄₃和treS-1基因片段的克隆
            2.4.1.3 P_{abrB-spoVG-LytR-mmgA}和treS-1基因片段的克隆
        2.4.2 表達質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.4.2.1 質(zhì)粒pHT01-P_srfA-treS的構(gòu)建
            2.4.2.2 質(zhì)粒pHT01-P₄₃-treS的構(gòu)建
            2.4.2.3 質(zhì)粒pHT01-P_{abrBspoVG-LytR-mmgA}-treS的構(gòu)建
        2.4.3 胞內(nèi)表達重組枯草芽孢桿菌的的構(gòu)建
            2.4.3.1 重組菌B.subtilis WB800n/pHT01-P_srfA-treS的構(gòu)建
            2.4.3.2 重組菌B.subtilis WB800n/pHT01-P₄₃-treS的構(gòu)建
            2.4.3.3 重組菌B.subtilis WB800n/pHT01-P_{abrBspoVG-LytR-mmgA}-treS的構(gòu)建
    2.5 重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶驗證
        2.5.1 重組枯草芽孢桿菌的搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶分析
        2.5.2 重組枯草芽孢桿菌在SL發(fā)酵罐中發(fā)酵產(chǎn)酶比較
    2.6 SDS-PAGE蛋白電泳分析
    2.7 本章小結(jié)
第3章 海藻糖合酶在枯草芽孢桿菌中的分泌表達
    3.1 引言
    3.2 實驗材料
        3.2.1 主要試劑
        3.2.2 主要儀器
        3.2.3 主要培養(yǎng)基和溶液
        3.2.4 主要菌株、質(zhì)粒和引物
    3.3 實驗方法
        3.3.1 目的基因片段的克隆
        3.3.2 分泌表達載體的構(gòu)建
            3.3.2.1 pHT01-P_srfA-PhoD/YwbN-treS表達載體的構(gòu)建
            3.3.2.2 pHT01-P₄₃-PhoD/YwbN-treS表達載體的構(gòu)建
            3.3.2.3 pHT01-P_{abrB-spoVG-LytR-mmgA}-PhoD/YwbN-treS表達載體的構(gòu)建
        3.3.4 免疫印跡(Western-blot)分析
    3.4 結(jié)果與討論
        3.4.1 基因的克隆
            3.4.1.1 P_srfA、PhoD、YwbN和treS基因片段的擴增
            3.4.1.2 P₄₃、PhoD、YwbN和treS基因片段的擴增
            3.4.1.3 P_{abrB-spoVG-LytR-mmgA}、PhoD、YwbN和treS兩個片段的擴增
        3.4.2 表達質(zhì)粒的構(gòu)建
            3.4.2.1 質(zhì)粒pHT01-P_srfA-PhoD/YwbN-treS的構(gòu)建
            3.4.2.2 質(zhì)粒pHT01-P₄₃-PhoD/YwbN-treS的構(gòu)建
            3.4.2.3 質(zhì)粒pHT01-P_{abrB-spoVG-LytR-mmgA}-PhoD/YwbN-treS的構(gòu)建
        3.4.3 分泌表達重組枯草芽孢桿菌的的構(gòu)建
            3.4.3.1 重組菌B.subtilis/pHT01-P_srfA-PhoD/YwbN-treS的構(gòu)建
            3.4.3.2 重組菌B.subtilis/pHT01-P₄₃-PhoD/YwbN-treS的構(gòu)建
            3.4.3.3 重組菌B.subtili/pHT01-P_{abrB-spoVG-LytR-mmgA}-PhoD/YwbN-treS的構(gòu)建
    3.5 重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶驗證
        3.5.1 分泌型重組枯草芽孢桿菌在5L發(fā)酵罐中發(fā)酵產(chǎn)酶比較
    3.6 免疫印跡(Western-blot)分析
    3.7 本章小結(jié)
第4章 重組枯草芽孢桿菌的發(fā)酵優(yōu)化
    4.1 引言
    4.2 實驗材料
        4.2.1 實驗菌株
        4.2.2 儀器設(shè)備
        4.2.3 實驗藥品
        4.2.4 主要試劑與培養(yǎng)基配制
    4.3 實驗方法
        4.3.1 菌株活化及酶活力測定
        4.3.2 磷酸鹽濃度對酶活的影響
        4.3.3 碳源對酶活的影響
        4.3.4 碳源濃度對酶活的影響
        4.3.5 添加金屬離子對酶活的影響
        4.3.6 不同pH對酶活的影響
        4.3.7 發(fā)酵后期降低溫度對酶活的影響
        4.3.8 流加不同濃度蔗糖對酶活的影響
    4.4 結(jié)果與討論
        4.4.1 磷酸鹽濃度對酶活的影響
        4.4.2 碳源及碳源濃度對酶活的影響
        4.4.3 添加金屬離子對酶活的影響
        4.4.4 不同pH對酶活的影響
        4.4.5 發(fā)酵后期降低溫度對酶活的影響
        4.4.6 流加不同濃度蔗糖對酶活的影響
    4.5 本章小結(jié)
第5章 總結(jié)與展望
    5.1 總結(jié)
    5.2 展望
參考文獻
致謝
在學期間主要科研成果



本文編號：4001559